Nghiên cứu quy trình ly trích và xác định hàm lượng Adenosine trong cao ethanol của đông trùng hạ thảo (Cordyceps Militaris) bằng HPLC-PDA

TÓM TẮT:

Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) có tên khoa học là Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng có nhiều giá trị dược liệu và được ứng dụng nhiều trong các thực phẩm chức năng và dược phẩm. Việc nghiên cứu về ĐTHT cũng như các nghiên cứu phương pháp ly trích các hợp chất có hoạt tính hóa học của chúng ngày càng được quan tâm. Nghiên cứu này đã nghiên cứu về quy trình ly trích và xác định hàm lượng Adenosine trong cao ethanol của đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả nghiên cứu ly trích Adenosine bằng phương pháp ngâm dầm với điều kiện tối ưu: dung môi ly trích ethanol 60%, tỷ lệ rắn lỏng 100/10 (mg/mL), thời gian ly trích 4 giờ, nhiệt độ 80^oC với hiệu suất cao khô thu được là 54,8% và hàm lượng Adenosine thu được 537,7 mg/kg.

Từ khóa: Adenosine, Cordyceps militaris, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, đông trùng hạ thảo.

1. Đặt vấn đề

Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thảo dược có nguồn gốc thiên nhiên để phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến, trong đó phải kể đến ĐTHT, một loại thảo dược mang những giá trị dược liệu thần kỳ. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, nấm ĐTHT có tác dụng bổ thận, bổ khí điều trị các trường hợp mệt mỏi, đổ mồ hôi về đêm, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, bệnh phổi, bệnh thận, suy thận, loạn nhịp tim và bệnh gan,… Hoạt chất chính có trong ĐTHT được kể đến là Cordycepin và Adenosine, có nhiều tác dụng trong dược phẩm, đặc biệt hoạt chất Adenosine chống viêm, ung thư, duy trì quá trình tuần hoàn, cải thiện sức khỏe, cải thiện khả năng sinh lý, ổn định thần kinh, tác dụng tốt trên phổi, hệ tim mạch, và thần kinh trung ương [1-2].

Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về nấm ĐTHT cho thấy những ứng dụng thần kỳ của nó trong y học, đồng thời cũng đã nghiên cứu xác định hàm lượng Adenosine và Cordycepin bằng phương pháp HPLC đối với hai loài ĐTHT phổ biến là C. militaris và C. sinensis [3-7]. Ngoài ra, còn có những nghiên cứu ly trích và phân lập một số hợp chất từ ĐTHT nuôi cấy tại Đà Lạt [8].

Cũng nghiên cứu về phương pháp ly trích ĐTHT, năm 2017, nhóm tác giả Lê Thị Huyền Trang đã nghiên cứu quy trình ly trích Adenosine và Cordycepin từ ĐTHT được nuôi trồng bằng phương pháp siêu âm, sử dụng dung môi ly trích là nước [9]. Bên cạnh đó, nhóm tác giả Jian Ya Ling và cộng sự đã nghiên cứu ly trích chất lỏng siêu tới hạn của Codycepin và Adenosine từ ĐTHT và tinh chế bằng phương pháp sắc ký ngược dòng tốc độ cao [9]. Ngoài ra, còn ly trích ĐTHT bằng phương pháp vi sóng của nhóm tác giả Li Deng và cộng sự [10-12] thực hiện nghiên cứu tối ưu hóa ly trích Axit Cordyielic và Codycepin bằng phương pháp phản ứng bề mặt từ ĐTHT được nuôi cấy bằng phương pháp có hỗ trợ vi sóng. Trong năm 2019, Zheng-Ming Qian và nhóm tác giả thực hiện nghiên cứu: xác định nhanh Adenosine trong ĐTHT bằng cách ly trích trực tiếp bằng máy HPLC: Bột mẫu Cordyceps cho vào cột bảo vệ và được ly trích bằng nước nóng ở 75^oC và áp suất 150bar trong 3 phút. Kết quả Adenosine lần lượt là 0,24% và 0,94% [13]. Nhìn chung, nghiên cứu các phương pháp ly trích hoạt chất từ ĐTHT được các nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở ly trích ĐTHT bằng dung môi nước, nhưng chưa nghiên cứu các dung môi khác nước như ethanol. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này sẽ thực hiện ly trích Adenosine trong ĐTHT và xác định hàm lượng Adenosine trong cao ethanol của ĐTHT (Cordyceps militaris) bằng phương pháp HPLC-PDA.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Phương tiện nghiên cứu

Vật liệu: ĐTHT (Cordyceps militaris) được nuôi trồng tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Trà Vinh.

Hóa chất có xuất xứ từ Merck: Chất chuẩn Adenosine (C₁₀H₁₃N₅O₄), Acetonitrile (CH₃CN), Methanol (CH₃OH).

Hóa chất có xuất xứ từ Trung Quốc: Methanol (CH₃OH), Ethanol (C₂H₅OH), Sodium Chloride (NaCl), Potassium dihydrogen phosphate (KH₂PO₄).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Quy trình chiết Adenosine trong ĐTHT

Mẫu ĐTHT được xử lí bằng cách cắt nhuyễn. Ở mỗi thí nghiệm khảo sát ta thực hiện cân chính xác 100mg ĐTHT cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào dung môi (ethanol và nước theo từng khảo sát) rồi đặt trên bếp gia nhiệt và bắt đầu gia nhiệt cho hệ thống đun cách thủy trong khoảng thời gian và nhiệt độ khảo sát. Sau khi kết thúc quá trình ly trích tiến hành cô khan dịch chiết. Sản phẩm dịch chiết được trích bằng cách: chuẩn bị phễu lọc tiến hành lọc dịch chiết thu được.

Hình 1: Mẫu Đông trùng hạ thảo

Hình 2: Thí nghiệm đun cách thủy

2.2.2. Xác định hàm lượng Adenosine trong ĐTHT bằng HPLC

Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện trên máy HPLC - PDA (Waters). Với cột ODS-C18 (250mm x 4.6mm x 5mm), detector PDA, tại bước sóng 260nm. Chương trình rửa giải isocratic với hệ pha động Acetonitrile/dung dịch đệm phosphat pH 6,5 (tỷ lệ 8/92). Nhiệt độ cột 25^oC. Tốc độ dòng: 0,6mL/phút. Thể tích tiêm 20mL.

2.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ly trích Adenosine trong cao ethanol của đông trùng hạ thảo

Tính hiệu suất cao khô: Ly trích ĐTHT trong dung môi, cô khan dịch ly trích thu được cao khô. Cân khối lượng cao khô chính xác bằng cân phân tích.

Tính hiệu suất cao khô thu được theo công thức: H (%) = (m_caokhô/m_mẫu)*100

Trong đó: m_{cao khô} là khối lượng cao khô thu được sau khi cô khan dịch chiết (mg), m_mẫu là khối lượng ĐTHT sử dụng để ly trích (mg).

Chỉ tiêu đánh giá: Các thí nghiệm được khảo sát dựa vào hiệu suất cao khô và diện tích peak Adenosine trong HPLC so với peak chuẩn Adenosine.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Đường chuẩn

Đường chuẩn Adenosine được dựng ở các nồng độ 4ppm, 8ppm, 16ppm, 32ppm và 64ppm.

Hình 3: Đường chuẩn Adenosine trong ĐTHT

3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Dung môi có tác dụng thẩm thấu vào trong mẫu, hòa tan và khuếch tán các hợp chất hữu cơ trong mẫu ra ngoài. Khảo sát dung môi nhằm tiến hành chọn ra loại dung môi nồng độ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly. So sánh giữa nước và ethanol ở các nồng độ khác nhau từ đó tìm ra dung môi tối ưu nhất.

Bảng 1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Kết quả tại Bảng 1 cho thấy nồng độ ethanol càng tăng lên thì khả năng ly trích Adenosine càng tăng và đạt hiệu suất cao nhất với ethanol 60%, nếu ethanol tăng lên 96% thì hiệu suất giảm. Điều này có thể lý giải là trong hợp chất Adenosine có các nhóm OH phân cực sẽ tương tác tốt với những hợp chất phân cực. Khi tăng hàm lượng hữu cơ thì sự tương tác giữa Adenosine và hỗn hợp dung môi tăng. Tuy nhiên, nếu hàm lượng hữu cơ tăng quá cao, đồng nghĩa với việc giảm độ phân cực của hỗn hợp dung môi. Khi độ phân cực dung môi giảm làm hạn chế sự lôi kéo Adenosine của dung môi. Hiệu suất cao khô thu được của dung môi ethanol 60% đạt cao nhất là 40,6%, mặc khác diện tích peak Adenosine thu được cũng đạt cực đại so với các nghiệm thức nước, ethanol 20%, ethanol 40%, ethanol 96%. Vì vậy, dung môi ethanol 60% là dung môi phù hợp cho quá trình ly trích Adenosine trên nấm ĐTHT.

3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ rắn lỏng đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Tỷ lệ rắn lỏng sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng Adenosine thu được sau quá trình ly trích, để tìm ra tỷ lệ rắn lỏng tối ưu nhất với thể tích dung môi phù hợp, ta tiến hành khảo sát tỷ lệ rắn lỏng.

Hình 4: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ rắn lỏng đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Kết quả cho thấy tỉ lệ 100mg/10mL cho hiệu suất cao khô chỉ 40,6 % nhưng hiệu suất ly trích Adenosine lớn nhất với diện tích peak lớn nhất tương ứng là 105.160 (µV*sec) cao hơn tỉ lệ 200mg/10mL với diện tích peak là 34.267 (µV*sec); nhưng khi giảm tỉ lệ xuống thì hiệu suất ly trích không còn cao là do lượng mẫu sử dụng không nhiều. Do vậy, chọn tỷ lệ rắn lỏng 100mg/10mL làm điều kiện tối ưu cho quy trình ly trích Adenosine trong nấm ĐTHT.

3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Thực hiện khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT thu được kết quả như sau

Hình 5: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Nhiệt độ ly trích tối ưu là mức nhiệt độ mà khi đó hàm lượng Adenosine thu được đạt giá trị lớn nhất. Nhiệt độ là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Nhiệt độ thấp làm giảm sự trương nở của ĐTHT, làm chậm quá trình xâm nhập của dung môi vào bên trong cấu trúc của ĐTHT. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm thôi ra nhiều tạp chất và làm giảm hiệu suất quá trình trích ly.

Kết quả cho thấy, độ chuyển hóa của các chất hữu cơ trong mẫu phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ khảo sát. Ở nhiệt độ 30^oC, hiệu suất ly trích khá thấp và không có sự khác nhau nhiều giữa quá trình không kết hợp siêu âm và có kết hợp siêu âm. Ở 80^oC, hiệu suất ly trích Adenosine khá cao đạt diện tích peak 105.160 (µV*sec) và thu được hiệu suất cao khô là 40,6%. Vì vậy, trong khảo sát này nhiệt độ 80^oC làm điều kiện tối ưu cho quy trình ly trích Adenosine trong nấm ĐTHT.

3.5 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ly trích đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Thời gian ly trích tối ưu là thời gian mà tại đó hàm lượng chất cần ly trích thu được gần như cực đại. Thời gian ly trích đóng vai trò quyết định hiệu suất của quá trình. Nếu ly trích trong thời gian ngắn thì lượng chất ly trích tách chưa hết hoàn toàn, do vậy sẽ làm thể tích dịch ly trích thu được nhỏ. Ngược lại, nếu ly trích vượt quá thời gian tối ưu làm tốn thời gian, tổn hao năng lượng và làm hàm lượng dịch ly trích giảm đi đáng kể.

Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ly trích đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT thu được như sau:

Hình 6: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ly trích đến hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Kết quả cho thấy, thời gian ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình ly trích. Ở mỗi nghiệm thức hiệu suất cao khô thu được ngày tăng theo thời thời gian ly trích. Tuy nhiên, từ 4-5h thì diện tích peak Adenosine thu được tăng không đáng kể tương ứng với 117.958 và 118.744 (µV*sec). Vì vậy, nghiệm thức thời gian ly trích 4h được lựa chọn là thời gian ly trích tối ưu cho quy trình ly trích Adenosine trong nấm ĐTHT.

3.6. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của số lần ly trích đến khả năng trích kiệt hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của số lần ly trích đến khả năng trích kiệt hàm lượng Adenosine trong ĐTHT thu được như sau:

Hình 7: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của số lần ly trích đến khả năng trích kiệt hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Kết quả khảo sát cho thấy hiệu suất cao khô và diện tích peak Adenosine thu được nhiều nhất ở lần ly trích đầu tiên và qua các lần ly trích 2 và 3 thì hầu như giá trị này không thay đổi đáng kể. Điều đó chứng tỏ ly trích bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi ethanol 60% đạt hiệu suất cao qua 1 lần ly trích. Vì vậy, trong khảo sát này nhóm chọn số lần ly trích là 1 lần làm điều kiện tối ưu cho quy trình ly trích Adenosine trong nấm ĐTHT.

3.7. Xác định hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

Sau khi thực hiện khảo sát quy trình ly trích Adenosine trong ĐTHT, tiếp tục tiến hành thực hiện ly trích Adenosine trong ĐTHT theo quy trình ly trích tối ưu, và xác định hàm lượng Adenosine bằng HPLC, đã thu được các số liệu như Bảng 2.

Bảng 2. Hàm lượng Adenosine trong ĐTHT

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này đã thực hiện ly trích và khảo sát các thông số ảnh hưởng lên quá trình ly trích Adenosine trong nấm ĐTHT được nuôi trồng tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Trà Vinh, cụ thể: dung môi tối ưu là ethanol 60%, tỉ lệ rắn lỏng 100mg/10mL, nhiệt độ ly trích là 80^oC, thời gian ly trích 4 giờ, và trích kiệt trong 1 lần trích. Sử dụng phương pháp phân tích trên thiết bị HPLC-PDA, cột ODS-C18 (250mm x 4.6mm x 5mm), tại bước sóng 260nm. Chương trình rửa giải isocratic với hệ pha động Acetonitrile/dung dịch đệm phosphat pH 6,5 (tỷ lệ 8/92). Nhiệt độ cột 30^oC, tốc độ dòng: 0,6 mL/phút. Thể tích tiêm 20µL. Từ đó, xây dựng được phương trình đường chuẩn y = 24.583x -14.086 với hệ số R² = 0.9911. Và xác định được hàm lượng Adenosine trong ĐTHT là 537,7mg/Kg. Cùng với những nghiên cứu về ứng dụng của ĐTHT trong dược phẩm và thực phẩm, đề tài nghiên cứu quy trình ly trích và xác định hàm lượng Adenosine trong cao ethanol của ĐTHT (Cordyceps Militaris) bằng HPLC-PDA càng có ý nghĩa quan trọng trong bổ sung nguồn dữ liệu nghiên cứu về dược liệu ĐTHT và định hướng ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Nguyễn Thị Liên Thương, Trịnh Diệp Phương Danh và Nguyễn Văn Hiệp, 2016. Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 44b: 9-22.
Nguyễn Ngọc Trai (2017), "Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh”, Báo cáo tổng kết đề tài NCKH cấp trường, Trường Đại học Trà Vinh, QT6.2/KHCN 1 - BM3.
Chử Văn Mến,Vũ Tuấn Anh, Nguyễn Văn Long và cộng sự (2015), “Nghiên cứu định lượng Adenosine trong Đông trùng hạ thảo (Cordyceps spp.) bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Y - Dược học quân sự, 9, pp. 18-23.
Nguyễn Thị Quế Mai (2015), “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời Adenosin và Cordycepin trong chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Dược Hà Nội.
Phạm Văn Hiển, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Thị Thủy và cộng sự (2016), "Đánh giá hàm lượng adenosin và cordycepin trong các bộ phận khác nhau của Đông trùng hạ thảo nuôi cấy (Cordyceps sinensis (Berk)) Sacc bằng phương pháp HPLC," Tạp chí Dược học, số 486 tr.28-32.
Phạm Văn Hiển, Lê Minh Hoàng, Lê Thị Huyền Trang và cộng sự (2017), “Nghiên cứu bào chế bột cao khô Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris L. Ex Fr. Link) nuôi cấy tại Việt Nam bằng phương pháp phun sấy”, Tạp chí Dược học, số 497, tr.70-73.
Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009). Determination and analysis of cordycepin and Adenosine in the products of Cordyceps spp. African Journal of Microbiology Research, 3(12), pp. 957-961.
Dương Ngọc Tú, Hồ Văn Khánh, Nguyễn Quyết Tiến và cộng sự (2018). Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) nuôi cấy tại Đà Lạt. Tạp chí Dược học, 1(T58).
Lê Thị Huyền Trang, Lê Minh Hoàng, Nguyễn Duy Bắc và cộng sự (2017). Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất adenosin và cordycepin từ Đông trùng hạ thảo nuôi cấy (Cordyceps militaris). Tạp chí Dược học, 4(T57).
Lê Thị Huyền Trang, Lê Minh Hoàng, Nguyễn Duy Bắc và cộng sự (2018). Extraction of Adenosine and cordycepin from spent solid medium of cordyceps militaris culture. Vietnam Journal of Science and Technology, 56(4A), pp.221-228.
Jian Ya Linga, Guo Ying Zhang, Jian Qun Lina, Zhao Jie Cui, Chang Kai Zhanga (2009). Supercritical fluid extraction of cordycepin and Adenosine from Cordyceps kyushuensis and purification by high-speed counter-current chromatography. Separation and Purification Technology, 66(3), pp. 625-629.
Li Deng, Tong-Yong Zhou, Li Pi, Xiao-Hui Zhao, Tao Han, Yi-Kang Li And Fa Han (2013). Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Cordycepic Acid and Cordycepin from Cultured Cordyceps militaris by Response Surface Methodology. Asian Journal of Chemistry, 25(14), pp.8065-8071.
Hardeep S. Tuli1, S. S. Sandhu, Dharambir Kashyap and Anil K. Sharma (2014). Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential of a bioactive metabolite, cordycepin from cordyceps militaris 3936. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(4), pp. 1525-1535.
Jiamin Li, Minyi Guan and Yi Li (2015). Effects of cooking on the contents of Adenosine and cordycepin in Cordyceps militaris. Procedia Engineering, 102,485-491.
Zheng-Ming Qian, Chun-Hong Li, Yue-Lin Song, Miao-Xia Zhou, and Wen-Jia Li (2019). Rapid determination of Adenosine in cordyceps by online extraction HPLC. Journal of Chromatographic Science, 57(4), pp.381-384.
Yung-Jen Tsai, Lie-Chwen Lin, and Tung-Hu Tsai (2010). Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin, a Bioactive Constituent of Cordyceps sinensis in Rat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(8), pp.4638-4643. DOI: 10.1021/jf100269g
Harry G. Brittain (1998). Analytical profiles of Drug Substances and Excipients. USA: Academic Press Inc.

A STUDY ON THE EXTRACTION PROCESS

AND DETERMINING THE CONTENT OF ADENOSINE

IN THE ETHANOLIC EXTRACT OF Cordyceps Militaris

BY USING THE HIGH-PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD

• Master. NGUYEN THI THU HA

• Master. NGUYEN NGOC TRAI

• Master. NGUYEN THIEN THAO

Tra Vinh University

ABSTRACT:

Cordyceps militaris, which is a species of parasitic on insects, have many medicinal values and they are used in functional foods and pharmaceutical products. Researches on Cordyceps militaris and methods of extracting chemical compounds from Cordyceps militaris have recently received attention. This study analyzes the extraction method and determines the content of Adenosin in the ethanolic extract of Cordyceps militaris by using the

high-performance liquid chromatography (HPLC) method. The Adenosin was extracted by using the soaking method with optimal conditions (60% ethanol extraction solvent, 100/10 liquid solid ratio (mg/mL), 4-hours of extraction, and at 80^oC) with the yield of 54,8% and the extracted Adenosin content is 537,7 mg/kg.

Keywords: Adenosine, Cordyceps militaris, high-performance liquid chromatography method, Cordyceps Fungi.