Thẩm định phương pháp phân tích 3,4-methylenedioxy methamphetamine trong mẫu máu bằng phương pháp hplc-ms/ms

TÓM TẮT:

Trong bài báo này, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép hai lần khối phổ (HPLC-MS/MS) đã được thẩm định và áp dụng để phân tích hàm lượng chất ma túy 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine (MDMA) trong mẫu máu. Ở điều kiện tối ưu của thực nghiệm, khoảng tuyến tính phân tích MDMA từ 0,5-500 µg/L với giới hạn phát hiện của phương pháp đạt 0,25 µg/L. Hiệu suất thu hồi đạt từ 86,9% tới 95,5%. Ở các mức nồng độ khác nhau của MDMA, độ lặp lại của phương pháp cao thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 6 lần thí nghiệm lặp lại nhỏ hơn 5,7%. Các chỉ số này đáp ứng rất tốt đối với một phương pháp phân tích định lượng ở nồng độ siêu vết.

Phương pháp được áp dụng để phân tích 1.890 mẫu máu thực tế được cung cấp từ Trung tâm Pháp y Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả thu được cho thấy số mẫu máu dương tính với MDMA là 0,32%. So sánh các mẫu dương tính với các loại ma túy khác, MDMA chiếm khoảng 3,2%. Bằng việc sử dụng đồng phân có 5 deuterium trong chất nội chuẩn (3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine-d5) và tín hiệu đo là phổ MS/MS, phương pháp này cho độ chính xác cao khi phân tích MDMA trong mẫu máu.

Từ khóa: Ma túy đá, MDMA, độc tố, HPLC-MS/MS.

1. Đặt vấn đề

Trong những thập kỷ gần đây, việc sử dụng trái phép 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine và các loại thuốc kích thích tâm thần khác đã tăng lên đáng kể ở nhiều quốc gia [1]. 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine là một trong những chất kích thích dạng amphetamine. Đây là loại thuốc có đặc tính kích thích hoặc gây ảo giác khi bị lạm dụng [2, 3]. Trong số các chất kích thích loại amphetamine, MDMA được biết đến là một chất kích thích mạnh mẽ của hệ thống thần kinh trung ương. MDMA đã được chứng minh là làm giảm biểu hiện kiểu hình của 5-HT trong toàn bộ não người trưởng thành [4, 5]. Một số bằng chứng chỉ ra sự mất kiểu hình đối với nhiễm độc thần kinh serotonin do MDMA gây ra ở người lớn [6, 7].

Để chẩn đoán và điều trị cho người nghiện ma túy, đánh giá nồng độ MDMA trong máu là một bước không thể thiếu. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đã được sử dụng để phân tích loại thuốc này trong nhiều năm [8, 9], nhưng đôi khi nó gặp khó khăn khi áp dụng do tính không bền nhiệt và phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi hơn. Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng song song hiệu năng cao đã được ưu tiên lựa chọn để xác định MDMA và các chất kích thích khác, nhưng các phương pháp này chỉ được sử dụng để phân tích các sản phẩm thuốc, mẫu nước tiểu [10, 11].

Phương pháp HPLC ghép nối khối phổ sử dụng kỹ thuật phân tích thời gian bay (TOF) của ion cũng được xác nhận để phân tích MDMA trong các mẫu máu [12]. Nhưng các thông số của phương pháp này chỉ được đánh giá bằng cách sử dụng mẫu máu trắng đồng thời chưa được áp dụng trên phân tích mẫu thực. Mục đích của nghiên cứu nhằm thẩm định một phương pháp có độ nhạy cao để xác định MDMA trong mẫu máu bằng HPLC-MS/MS từ đó áp dụng phân tích MDMA trong mẫu thực. Bằng cách sử dụng đồng phân chứa năm đồng vị deuterium so với chất chuẩn (MDMA-d5) việc sử dụng 2 lần khối phổ với chế độ MRM. Phương pháp này hứa hẹn tính đặc hiệu và độ nhạy cao trong phân tích. Ngoài ra, bằng cách sử dụng mẫu máu thực trong xác định giá trị thông số đặc trưng, hứa hẹn phương pháp phân tích đạt được với độ tin cậy cao và có thể được áp dụng cho chẩn đoán, điều trị hoặc nghiên cứu độc tính thuốc.

2. Thực nghiệm

2.1. Hóa chất và thiết bị

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong đề tài này đều đạt độ tinh khiết dùng trong Hóa phân tích (PA):

3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine (MDMA) 1mg/mL trong methanol và 3,4-Methylenedioxy-N-methamphetamine-d5

1mg/mL trong methanol cung cấp bởi Sigma-Aldrich (Singapore). Acetonitrile (ACN), methanol, acetone, dichloromethane, 2-Propanol, NH4OH 25%, KH2PO4, Na2HPO4 mua từ hãng Merck (Merck, Darmstadt, Germany). Tất cả các dung dịch được pha trong nước siêu tinh khiết (với điện trở >18,3 M?cm) được cất bộ cất nước Millipore Milli Q system (Billerica, MA, USA). Dung dịch chuẩn, nội chuẩn và chuẩn làm việc (100 mg/L) được pha từ chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/L. Những dung dịch này được lưu trữ ở 40C và được sử dụng trong 3 tháng.

2.2. Phương pháp xử lý mẫu và phân tích mẫu máu bằng HPLC-MS/MS

Mẫu máu được xử lý theo các quy trình đã công bố trước đây [13, 14] và được mô tả một cách ngắn gọn như sau: 2 ml mẫu máu được thêm vào 250 µL MDMA-d5 2 mg/L vào một ống li tâm dung tích 15 ml, lắc trộn hỗn hợp này bằng máy lắc trong vòng 15 phút, sau đó để yên trong 10 phút. Ly tâm hỗn hợp thu được ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 5 phút, thu hồi phần dung dịch phía trên và tiến hành tách làm giàu các chất phân tích bằng cột chiết C18 theo 4 bước:

(1) Kích hoạt cột bằng 1 mL metanol, 1 mL nước cất và 1 mL dung dịch đệm phosphate (pH = 6);

(2) Chuyển 1 mL dung lịch mẫu (sau li tâm) chạy qua cột trong vòng 1 phút;

(3) Loại trừ tạp chất trên cột bằng 5 ml dung dịch hỗn hợp nước cất/acetone (20:80, v/v), chờ dung dịch rửa hoàn toàn chảy ra khỏi cột trong vòng 5 phút;

(4) Rửa giải chất phân tích trên cột bằng 1 mL metanol. Dung dịch thu được được làm bay hơi và pha loãng lại trong 500 mL MeOH và sau đó được lọc qua giấy lọc 0,45 mm. Dung dịch sau lọc được phân tích bằng hệ thống HPLC-MS/MS dưới các điều kiện của phương pháp đã được khảo sát và được trình bày như trong Bảng 1.

Bảng 1. Thông số vận hành của hệ thống GC-MS/MS phân tích

MDMA trong mẫu máu

Thông số
HPLC- Agilent 1290 Infinity
Cột tách	Agilent Eclipse Plus C18 RRHD analytical column, 2,1 × 100 mm, 1,8 µm (959757-902)
Nhiệt độ tách	30^oC
Tốc độ dòng	0,3 mL / min
Pha động	Nước cất chứa 0,1% formic acid (A), acetonitrile (B)
Chương trình dung môi (%B, min)	initial, 80%; 1 phút, 80%; 2,2 phút, 100%; 2,8 phút, 80%
Thể tích mẫu tiêm	5 µL
MS-Agilent 6490 Triple Quad
Capillary (Vcap)	4000 V (Positive)
Nhiệt độ khí mang	350^oC
Tốc độ khí mang	He, 11 L/min
Nebulizer	35 psi
Thế Nozzle	1500 V (Positive)
Thế RF	110-200 V (Positive)

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Độ đặc hiệu của phương pháp

Để thẩm định độ chính xác của phương pháp phân tích MDMA trong mẫu máu, các thông số như độ đặc hiệu, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ đúng và độ lặp được đánh giá theo hướng dẫn như quy định trong các tài liệu EC/657/2002, ISO 17025: 2017 và AOAC 2016 [15-17].

Độ đặc hiệu của phương pháp được xác minh bằng cách phân tích mẫu trắng và các mẫu thêm chuẩn. Phổ sắc ký được khảo sát ở chế độ MRM với tín hiệu mảnh với mảnh phổ sơ cấp của MDMA và MDMA-d5 lần lượt là 193,9 và 199. Mảnh ion thứ cấp của MDMA có độ nhạy cao dùng để định lượng là 163,1. Mảnh thứ cấp của MDMA-d5 có độ nhạy cao để định lượng là 164,9 (Hình 1).

Như kết quả được trình bày trong Hình 2, không có tín hiệu nào thu được trong phổ sắc ký của mẫu trắng, chứng tỏ không có hoạt chất ma túy MDMA trong mẫu máu blank được chọn (Hình 2A). Ngược lại, khi thêm 1µg/mL MDMA vào mẫu trắng trên, một peak đơn đã xuất hiện tại thời gian lưu 0,407 phút, (Hình 1B). Sự khác biệt về tín hiệu peak do nồng độ MDMA thay đổi từ 1µg/mL đến 10 µg/mL với diện tích peak thay đổi từ 5833 (Hình 2B) tới 22948 (Hình 2C), điều này xác nhận tính đặc hiệu cao của phương pháp.

3.2. Khoảng nồng độ định lượng hoạt chất

Khoảng tuyến tính dùng để định lượng hoạt chất ma túy MDMA trong mẫu máu được khảo sát dựa trên phương pháp nội chuẩn. Phương trình hồi quy được xây dựng là tương quan giữa tỷ lệ diện tích peak của MDMA so với diện tích peak của chất nội chuẩn MDMA-d5 với tỷ lệ nồng độ. Kết quả thu được về khoảng tuyến tính, phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan được trình bày trong Bảng 2.

Đường hiệu chuẩn thu được với nồng độ MDMA nằm trong khoảng từ 0,5 đến 500 µg/kg và với hệ số tương quan (R2) là 0,999. Sự ổn định tuyến tính cũng được khảo sát trong 3 ngày khác nhau, hệ số tương quan thu được đều đạt 0,999. Giá trị này cao hơn nhiều so với yêu cầu cần thiết cho phương pháp phân tích định lượng (0,995).

3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL), giới hạn định lượng phương pháp (MQL) xác định MDMA trong mẫu máu được tính toán dựa trên kết quả phân tích mẫu thêm chuẩn. Qua 11 thí nghiệm lặp lại cho 3 mẫu thêm chuẩn được thực hiện. MDL được tính bằng 3 lần độ lệch chuẩn (SD) và MQL bằng 10 lần SD. Kết quả được trong Bảng 3.

Như thể hiện trong Bảng 4, MDL, MQL của phương pháp lần lượt thấp hơn 0,25 µg/L và 0,84 µg/L cho thấy độ nhạy của phương pháp rất cao và cao hơn so với công bố gần nhất khi phân tích MDMA trong máu bằng phương pháp HPLC ghép nối khối phổ sử dụng kỹ thuật phân tích thời gian bay của ion (TOF) [12]. Cũng với ngưỡng định lượng này, phương pháp hoàn toàn có thể ứng dụng để phân tích mẫu thực cho việc chuẩn đoán và điều trị theo ngưỡng độc tính của MDMA trong máu > 100 µg/L [18].

3.4. Độ đúng và độ lặp của phương pháp

Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp được xác nhận dựa trên phân tích các mẫu thêm chuẩn ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao. Hiệu suất thu hồi ở các mức nồng độ 10, 100, 300 µg/L tương ứng thu được là 86,9, 91,3 và 95,5% (Bảng 4). Các giá trị này đều cao hơn nhiều so với yêu cầu đối với phương pháp định lượng từ 1 µg/L tới 1 mg/L là từ 65-110%.

Độ lặp lại của phương pháp được xác định khi phân tích lặp 6 trên 3 mẫu thực có nồng độ khác nhau là 8,7, 46 and 68,4 µg/L. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) quan sát được tương ứng là 5,7%, 4,8%, 4,3%. Giá trị thu được cho thấy độ tái lặp của phương pháp cao hơn nhiều so với yêu cầu đối với phương pháp phân tích định lượng ở mức nồng độ từ 1 µg/L tới 1 mg/L (16-45%).

3.5. Ứng dụng phương pháp trên phân tích mẫu thật

Phương pháp được ứng dụng để phân tích 1.890 mẫu máu thực tế. Các mẫu máu này được lấy tại Trung tâm pháp y Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả phân tích ghi nhận 6 trường hợp dương tính với MDMA chiếm 0,32% tổng số mẫu. So sánh với tổng số mẫu dương tính với nhiều loại ma túy khác như methamphetamine, morphine, codeine và ketamine, số mẫu dương tính của MDMA chiếm 3,2%. Trong 6 mẫu dương tính, 5 mẫu dương tính nằm trong khoảng từ 0,070 mg/L tới 0,108 mg/L và nằm trong khoảng nồng độ điều trị của MDMA (0,1-0,35). 01 mẫu dương tính có nồng độ là 0,365 mg/L nằm trong khoảng gây độc (0,35-0,5) [19]. Tuy nồng độ của MDMA trong mẫu máu chưa đạt đến ngưỡng gây độc sơ cấp nhưng đây là những trường hợp chất kích thích gây ảo giác cho người sử dụng dẫn đến tử vong khi không kiểm soát được hành vi.

4. Kết luận

Phương pháp phân tích định lượng có độ chính xác cao đã được thẩm định để phân tích MDMA trong các mẫu máu bằng HPLC-MS/MS và chất nội chuẩn là đồng phân deuterium của chất chuẩn. Đường hiệu chuẩn thu được trong khoảng nồng độ rộng từ 0,5-500 µg/L và hệ số tương quan rất cao (R2 = 0,999) với giới hạn phát hiện phương pháp thấp hơn 0,3 µg/L. Những thông số này cho phép phương pháp ứng dụng trong phạm vi nồng độ rộng và nhạy cao. Độ đúng và độ tái lặp của phương pháp tốt hơn nhiều so với yêu cầu cần thiết đối với một phương pháp định lượng ở nồng độ ppb. Phương pháp đã được ứng dụng để phân tích MDMA trong các mẫu thực và có thể áp dụng trong nghiên cứu, chẩn đoán hoặc điều trị nghiện ma túy.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Cadet, J.L., Krasnova, I.N., Jayanthi, S., Lyles, J. (2007. Neurotoxicity of substituted amphetamines: Molecular and cellular mechanisms. Neurotoxicity Research, 11, 183-202.
Halpin, L.E., Collins, S.A., Yamamoto, B.K. (2014). Neurotoxicity of methamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine. Life sciences, 97, 37-44.
Yu, S., Zhu, L., Shen Q., Bai, X., Di, X. (2015). Recent advances in methamphetamine neurotoxicity mechanisms and its molecular pathophysiology. Behavioural neurology, 103969, 11.
Lipton, J.W., Tolod, E.G., Thompson, V.B., Pei, L., Paumier, K.L. (2008). Terpstra, B.T., 3,4-Methylenedioxy-N-methamphetamine (ecstasy) promotes the survival of fetal dopamine neurons in culture. Neuropharmacology, 55, 851-859.
Morgan, M.J., McFie, L., Fleetwood, L.H., Robinson, J.A. (2002). Ecstasy (MDMA): are the psychological problems associated with its use reversed by prolonged abstinence?. Psychopharmacology, 159, 294-303.
Pantoni, M.M., Anagnostaras, S.G. (2019). Cognitive effects of MDMA in laboratory animals: A systematic review focusing on dose. Pharmacological Reviews, 71, 413-449.
Song, B.J., Moon, K.H., Upreti, V.V., Eddington, N.D., Lee, I.J. (2010). Mechanisms of MDMA (Ecstasy)-Induced oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and organ damage. Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 434-443.
Jurado, C., Giménez, M.P., Soriano, T., Menéndez, M., Repetto, M. (2000). Rapid analysis of amphetamine, methamphetamine, MDA, and MDMA in urine using solid-phase microextraction, direct on-fiber derivatization, and analysis by GC-MS. Journal of Analytical Toxicology, 24, 11-16.
Stout, P.R., Horn, C.K., Klette, K.L. (2002). Rapid simultaneous determination of amphetamine, methamphetamine, 3,4-Methylenedioxyamphetamine, 3,4-Methylenedioxymethamphetamine, and 3,4-Methylenedioxyethylamphetamine in urine by solid-phase extraction and GC-MS: A method optimized for high-volume laboratories. Journal of Analytical Toxicology, 26, 253-261.
Kim, J.Y., Cheong, J.C., Ko, B.J., Lee, S.K., Yoo, H.H., Jin, C., In, M.K. (2008). Simultaneous determination of Methamphetamine, 3,4-MethylenedioxyN-methylamphetamine, 3,4-Methylenedioxy-N-ethylamphetamine, N, N-Dimethylamphetamine, and their metabolites in urine by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Archives of Pharmacal Research, 31,1644-1651.
Vazquez-Roig, P., Blasco, C., Picó, Y. (2013). Advances in the analysis of legal and illegal drugs in the aquatic environment. Trends in Analytical chemistry, 50, 65-77.
Minakata, K., Nozawa, H., Yamagishi, I., Hasegawa, K., Wurita, A., Gonmori, K. (2014). MALDI-TOF mass spectrometric determination of four amphetamines in blood. Forensic Toxicology, 32, 299-304.
Lee, M. R., Yu, S.C., Lin, C.L., Yeh, Y.C. (1997). Solid-phase extraction in amphetamine and methamphetamine analysis of urine. Journal of Analytical Toxicology, 21, 278-282.
Oyler, J.M., Cone, E.J., Joseph, R.E., Jr, Moolchan, E.T., Huestis, M.A. (2002). Duration of detectable methamphetamine and amphetamine excretion in urine after controlled oral administration of methamphetamine to humans. Clinical Chemistry, 48, 1703-1714.
European Commission (2002). Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. (2002/657/EC). Official Journal of the European Communities, L221, 8-36.
AOAC International. (2016). Appendix F: guidelines for standard method performance requirements. Journal of AOAC International.
International Standard. (2017). General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. ISO/IEC 17025.
Schulz, M., Schmoldt, A. (2003). Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. Pharmazie, 58, 447-474.

The validation of the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method to determine the 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine (MDMA) in blood sample

BSc. NGUYEN TRONG TUAN

Forensic Medicine Centre of Ho Chi Minh City

MSc. NGUYEN VIET DOANH

Forensic Medicine Centre of Ho Chi Minh City

PhD. NGUYEN VAN TRONG

Industrial University of Ho Chi Minh City

PhD. LE DINH VU

Industrial University of Ho Chi Minh City

ABSTRACT:

This study examines the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method to determine the 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine (MDMA) in blood sample. Under the optimal experimental conditions, the concentration of MDMA can be determined in the range from 0.5 µg/L to 500 µg/L with the method detection limit (MDL) of 0.25 µg/L. The practical applicability of the method is performed with the recovery is from 86.9 % to 95.5%. At the different concentrations of MDMA, the relative standard deviations (RSD) of 6 experiments are lower than 5.7%. This method has been applied to analyse 1,890 blood samples that are collected from the Forensic Medicine Centre of Ho Chi Minh City. The results show that 0.32% of tested blood samples are positive with MDMA. The MDMA accounts for 3.2% of the total blood samples which are positive with drugs. By using deuterium-labelled 3,4-methylenedioxy-N-methamphetamine-d5 as the internal standards in the determination and the use of MS/MS in multiple reaction monitoring mode signal readout, this method exhibits robustness specificity and can be applied in determination MDMA in blood with high selectivity and sensitivity.

Keywords: Methamphetamine MDMA, toxicology, HPLC-MS/MS.