Tổng hợp xanh và đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum spp., khuẩn Xanthomonas sp. của nano đồng

Phạm An Dương Khang - Nguyễn Thị Thu Hà - Nguyễn Ngọc Trai - Nguyễn Thiện Thảo (Trường Đại học Trà Vinh)

TÓM TẮT:

Các hạt nano đồng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như kháng khuẩn và kháng nấm, đã thu hút được sự chú ý đáng kể của các nhà khoa học. Trong nghiên cứu này, các hạt nano đồng được tổng hợp bằng phương pháp xanh sử dụng dịch chiết từ lá bàng (Terminalia catappa L.) làm tác nhân khử ion đồng (II) có trong dung dịch đồng nitrate. Các hạt nano đồng tạo ra trong dung dịch phản ứng được theo dõi bằng máy quang phổ UV-Vis và kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy - TEM), đánh giá khả năng kháng khuẩn Xanthomonas sp. và nấm Colletotrichum spp. Kết quả cho thấy, hạt nano bạc được tổng hợp có kích thước từ 5-20 nm. Dung dịch nano bạc tạo thành có khả năng kháng cả khuẩn Xanthomonas sp. và nấm Colletotrichum spp.

Từ khóa: Lá bàng, khuẩn Xanthomonas sp., nấm Colletotrichum spp., nano đồng.

1. Đặt vấn đề

Trong điều kiện thời tiết khí hậu nắng nóng, mưa nhiều, xuất hiện nhiều cơn bão liên tục là điều kiện thuận lợi cho các loài nấm bệnh, vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng. Bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra rất nguy hiểm và gây nhiều khó khăn cho công tác phòng trừ vì thời gian ủ bệnh rất khó phát hiện.

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại rất phổ biến và nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng, từ cây rau màu như ớt, cà chua, bầu bí, dưa,… đến các loại cây ăn trái như xoài, sầu riêng, đu đủ, chuối, thanh long,… Không những thế, bệnh thán thư còn gây hại phổ biến trên nhiều loại cây công nghiệp như đậu nành, bông vải, trà, cà phê, hồ tiêu,… và nhiều cây hoa cảnh như mai vàng, cúc, lan,… Tại Sóc Trăng, bệnh thán thư gây hại nghiêm trọng trên các loại cây ăn trái như xoài, cây có múi, nhãn, ổi, sầu riêng, chôm chôm, măng cụt,… [1].

Bệnh loét do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra, bệnh gây hại đến tất cả bộ phận trên cây có múi, làm rụng lá, quả, cây còi cọc chóng bị tàn, mất vẻ thẩm mỹ của quả và khiến quả không thể xuất khẩu được. Bệnh gây hại nặng vào mùa mưa. Ban đầu bệnh xuất hiện trên lá non. Vết bệnh là những chấm nhỏ như vết kim châm có đường kính dưới 1 mm màu vàng sáng. Sau đó bệnh phát triển nhanh thành những vết bệnh màu nâu nhạt. Đường kính vết bệnh biến thiên theo giống trồng, trên bưởi thì vết bệnh thường lớn hơn cam quýt và chanh. Xung quanh vết bệnh có quầng tròn dạng giọt dầu, màu nâu hoặc xanh tối, các vết bệnh có thể liên kết với nhau thành từng mảng lớn, đặc biệt bệnh nhiễm theo các vết đục của sâu vẽ bùa. Sau 2 - 3 tuần, vết bệnh phát triển thành loét hình tròn màu nâu xám. Vết loét không ăn sâu vào ruột quả, khi quả bệnh nặng các vết bệnh liên kết lại với nhau thành từng màng lớn và làm cho quả biến dạng ít nhiều [2].

Theo Vũ Bá Quang [1] - Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Kế Sách tỉnh Sóc Trăng, cách phòng trừ bệnh thán thư là sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật tác động tiếp xúc có tác dụng chủ yếu là phòng bệnh và hạn chế nguồn bệnh lây lan như các thuốc gốc đồng, Mancozel, Propinel,…

Những biện pháp cơ học và sinh học phòng trừ bệnh thán thư do nấm Collectrotrichum spp. và bệnh loét quả do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra chủ yếu là: phòng trừ bằng biện pháp canh tác, vi sinh đối kháng,… vẫn chưa mang tính đặc hiệu cao, cũng như là chưa phòng trừ triệt để bệnh thán thư do nấm Collectrotrichum spp. và bệnh loét quả do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra và chỉ được áp dụng đối với những vườn cây bị bệnh nhẹ hoặc mới phát.

Đối với việc phòng trừ nấm bệnh và vi khuẩn trên cây trồng bằng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và môi trường. Đối với sự ảnh hưởng đến môi trường, thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây ô nhiễm không khí, nguồn nước ngầm, phá vỡ cấu trúc đất, và giảm mạnh số lượng của các chủng loại sinh vật.

Nano đồng với các tính chất đặc biệt của vật liệu nano có thể kháng nấm bệnh và vi khuẩn chỉ với liều lượng rất nhỏ so với thuốc bảo vệ thực vật hóa học thông thường và các thuốc gốc đồng. Cơ chế diệt khuẩn của hạt nano đồng là: khuếch tán trực tiếp vào màng tế bào vi khuẩn thông qua các vi lỗ hiện diện trong màng tế bào do kích thước vô cùng nhỏ của chúng, hoặc các hạt nano đồng xâm nhập qua kênh vận chuyển ion và protein có mặt trên màng plasma. Ngoài ra, một số hạt nano có thể xâm nhập vào tế bào thông qua endocytosis (các túi bao bọc và vận chuyển các hạt nano đồng oxit vào trong màng tế bào). Sau khi xâm nhập vào màng tế bào, hạt nano đồng sẽ giải phóng ion Cu2+ gây ra nhiều phản ứng sinh hóa. Các phản ứng này sẽ phá hủy cấu trúc bên trong tế bào của nấm và vi khuẩn, dẫn đến chết tế bào và tiêu diệt được nấm và vi khuẩn [3].

Việc tổng hợp nano đồng có thể thực hiện theo nhiều phương pháp như: Phương pháp phân hủy nhiệt [4], phương pháp có sự hỗ trợ của sóng siêu âm [5], phương pháp điện hóa [6], phương pháp khử hóa học [7],… Tuy nhiên,  phương pháp tổng hợp xanh của hạt nano đồng từ dịch chiết thực vật góp phần tiết kiệm chi phí, bảo vệ sức khỏe con người, giảm tác động đến môi trường và cũng là một phương pháp thay thế cho nhiều phương pháp vật lý và hóa học hiện có [8]. Đặc biệt, trong dịch chiết lá bang (Terminalia catappa L.) có chứa các hợp chất Flavonoid, Tannin, Saponin, Alkaloid, các Polyphenol,… chứa các nhóm chức -OH, -C=O là những tác nhân khử về kích thước nano hiệu quả [9].

Chính vì vậy, vấn đề nghiên cứu tổng hợp dung dịch chứa hạt nano đồng định hướng phòng trừ nấm Collectotrichum spp. và vi khuẩn Xanthomonas spp. mang nhiều ý nghĩa quan trọng, sử dụng lá bàng là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có nhiều ở các địa phương, phù hợp với xu hướng hóa học xanh hiện tại.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Phương tiện nghiên cứu

Vật liệu: Mẫu lá bàng được thu hái xung quanh khuôn viên Trường Đại học Trà Vinh. Mẫu nấm Collectotrichum spp. và vi khuẩn Xanthomonas spp. là hai chủng vi sinh vật gây bệnh được phân lập và lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Nông nghiệp - Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh.

Trang thiết bị, dụng cụ: Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV- Vis (SHIMAZDU-UV-Vis 1800), hệ thống lọc chân không,…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuẩn bị dịch trích

Lá bàng sau khi thu về, rửa sạch với nước thủy cục và rửa lại với nước deion, sấy ở 500oC sau đó cắt nhỏ, để trong túi nilon bịt kín, bảo quản ở 4oC để dùng cho các thí nghiệm. Quá trình ly trích dịch chiết: Cân 10g lá bàng đã sấy khô cắt nhỏ như trên, cho vào erlen 250mL, cho vào erlen 100mL nước deion sau đó đun sôi 15 phút, sau khi đun để nguội ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết sau đun được lọc qua màng lọc Whatman No.1.

2.2.2. Tổng hợp nano đồng

Phản ứng khử Cu2+ về kích thước nano: Hút 40 mL dung dịch Cu2+ 1 mM cho vào beaker 100 mL, sau đó cho từ từ 10mL dịch chiết vào, hỗn hợp phản ứng được giữ ở nhiệt độ phòng. Dung dịch sau phản ứng được quét bước sóng từ 380-550 nm bằng máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV- Vis (SHIMAZDU-UV-vis 1800) tại Trường Đại học Trà Vinh, kích thước hạt nano được đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua tại Phòng Hiển vi điện tử thuộc Viện Khoa học Vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Khảo sát khả năng kháng nấm Collectotrichum spp. của dung dịch chứa hạt nano đồng

Xác định khả năng ức chế nấm Collectotrichum spp. của nano đồng trong môi trường PDA được thực hiện theo nghiên cứu của Phan Thị Hồng Thảo và cộng sự [10].

Tiến hành thí nghiệm: Các thông số tối ưu được chọn bên trên được sử dụng để tạo dung dịch nano đồng từ dịch chiết thực vật. Môi trường PDA được thêm vào 50 µL, 100 µL, 200 µL, 400 µL, 800 µL dung dịch chứa hạt nano đồng trong 50 mL môi trường tương ứng với 1000 µl/L, 2000 µl/L, 4000 µl/L, 8000 µl/L, 16000 µl/L nano đồng trong môi trường PDA, áp dụng nồng độ môi trường PDA tương tự với nano đồng cho các mẫu đối chứng là: đối chứng âm nước deion, đối chứng dương 1 là dịch chiết lá bàng, đối chứng dương 2 là dung dịch Cu2+ nồng độ 2 mM, mỗi tỉ lệ (dung dịch nano đồng: môi trường) lặp lại thí nghiệm 3 lần tương ứng với 3 đĩa petri cho cả nano đồng và các mẫu đối chứng. Nấm Collectotrichum spp. sau khi phân lập sẽ được nuôi cấy trong môi trường PDA lỏng 48 giờ, sau đó hút khoảng 20 µL cho vào tâm đĩa petri môi trường chứa môi trường PDA đặc. Cho các đĩa petri của thí nghiệm vào bình hút ẩm, đốt đèn sáp, đậy nắp bình chờ đến khi đèn tắt. Để bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Quan sát và ghi nhận đường kính nấm, rồi từ đó tính ra tỉ lệ % ức chế của nano đồng lên nấm Collectotrichum spp.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu quả ức chế của nano đồng được tính theo công thức:

CT

Trong đó: R là đường kính trên đĩa đối chứng 0ppm; r là đường kính tương ứng với các mẫu cần xác định.

2.2.4. Khảo sát khả năng kháng khuẩn Xanthomonas sp. của dung dịch chứa hạt nano đồng

Xác định khả năng ức chế của sản phẩm cần thử nghiệm trong giếng thạch, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh giếng. Vùng ức chế càng lớn, tác dụng của sản phẩm cần thử nghiệm càng mạnh [11].

Tiến hành thí nghiệm: Các thông số tối ưu được chọn bên trên được sử dụng để tạo dung dịch chứa hạt nano đồng từ dịch chiết lá bàng. Môi trường NA được hấp khử trùng và rót ra đĩa petri với mỗi đĩa 20 mL môi trường, để cho môi trường đặc. Dòng vi khuẩn Xanthomonas sp. được nuôi trong môi trường NA lỏng 48 giờ, pha loãng và đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu. Hút 50µL huyền phù vi khuẩn mật số 106 tb/mL cho vào đĩa petri có môi trường NA, trãi đều bằng que cấy trang. Tạo 4 giếng có đường kính 5 mm trên môi trường đã trãi vi khuẩn. Hút 50 µL nước cất khử trùng cho vào giếng số 1 Đối chứng âm; 50 µL dịch chiết lá bàng cho vào giếng số 2 Đối chứng dương 1; 50 µL dung dịch Cu2+ 2 mM cho vào giếng số 3; 50 µL dung dịch nano đồng cho vào giếng số 4. Để yên 30 phút cho dịch chiết khuếch tán từ giếng vào môi trường. Cho các đĩa petri thí nghiệm vào bình hút ẩm, đốt đèn cầy, đậy nắp bình chờ đến khi đèn tắt. Để bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn nếu có.

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) được tính theo công thức: C = D - d

Trong đó: C là đường kín vòng vô khuẩn (mm); D là đường kính vòng sáng halo xung quanh giếng thạch (mm); d là đường kính giếng thạch (mm).

2.3. Xử lý số liệu  

Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excell 2010 và phần mềm thống kê Stagraphic Centurion XVI.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Tổng hợp nano đồng

Quá trình phản ứng để khử Cu2+ về kích thước nano: Hút 40mL dung dịch Cu2+ 1 mM cho vào beaker 100mL, sau đó cho từ từ 10mL dịch chiết vào, hỗn hợp phản ứng được giữ ở nhiệt độ phòng.

Thí nghiệm đối sánh của dịch chiết và dung dịch Cu2+ được thực hiện tương tự như quá trình tạo nano đồng nhưng thay đổi dung dịch Cu2+ bằng nước deion cho thí nghiệm đối sánh là dịch chiết và thay đổi dịch chiết bằng nước deion cho thí nghiệm đối sánh là dung dịch Cu2+.

Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự tạo thành hạt nano đồng trong dung dịch phản ứng, với đỉnh hấp thu cực đại tại 410 nm. Kết quả chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy hạt nano đồng tạo thành có kích thước từ từ 5-20 nm.

Hình 1: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (HR-TEM) của hạt nano đồng được tổng hợp bằng tác nhân khử dịch chiết lá bàng

Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (HR-TEM)

3.2. Khảo sát khả năng kháng nấm Collectotrichum spp. của dung dịch chứa hạt nano đồng

Kết quả kiểm tra khả năng kháng nấm Collectotrichum spp. của nano đồng với các mẫu đối chứng là: dung dịch Cu2+ 2mM và dịch chiết lá bàng với tỉ lệ rắn lỏng (1:10) lên chủng nấm Collectotrichum spp. được trình bày ở Bảng 1. Kết quả cho thấy phần trăm ức chế nấm Collectotrichum spp. tăng dần khi tỉ lệ dung dịch ức chế/môi trường (µL/L) tăng dần. Phần trăm ức chế tăng tuyến tính từ nồng độ môi trường 0 (µL/L) đến 16000 (µL/L), ở nồng độ 16000 (µL/L) cho khả năng ức chế mạnh nhất, phần trăm ức chế ở nồng độ 16000 (µL/L) lên đến 74,50%. Trên đĩa có nồng độ môi trường 16000 (µL/L) lượng tơ nấm thưa, nấm phát triển rất yếu.

Bảng 1. Kết quả ức chế nấm Collectotrichum spp. của mẫu 0 và các tác nhân ức chế: nano đồng, muối Cu2+ và dịch chiết lá bàng

Kết quả ức chế nấm Collectotrichum spp.

Đối với chất ức chế là dung dịch Cu2+ thì khả năng ức chế nấm rất yếu, ở nồng độ môi trường 1000 (µL/L) thì nấm không bị ức chế, phần trăm ức chế nấm mạnh nhất là 24,17% ở nồng độ 16000 (µL/L). Từ kết quả trên cho thấy sự ảnh hưởng của dung dịch Cu2+ lên hiệu quả ức chế nấm Collectotrichum spp. là không đáng kể.

Khả năng ức chế nấm Collectotrichum spp. của chất ức chế là dịch chiết lá bàng cũng rất yếu, phần trăm ức chế nấm mạnh nhất là 12.08% ở nồng độ 16000(µL/L). Từ kết quả trên cho thấy sự ảnh hưởng của dịch chiết lá bàng lên hiệu quả ức chế nấm Collectotrichum spp. là không đáng kể.

3.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn Xanthomonas sp. của nano đồng

(1) Đối chứng âm (nước cất khử trùng); (2) Đối chứng dương 1 (dịch chiết ly trích từ thực vật); (3) Đối chứng dương 2 (Dung dịch Cu2+ được sử dụng tạo nano đồng); (4) Dung dịch nano đồng tổng hợp

Hình 2: Kết quả ức chế khuẩn Xanthomonas sp. của nano đồng

Kết quả ức chế khuẩn Xanthomonas sp. của nano đồng

Bảng 2. Kết quả ức chế khuẩn Xanthomonas sp. của dung dịch chứa hạt nano đồng và các mẫu đối chứng

Kết quả ức chế khuẩn Xanthomonas sp.

Từ kết quả ở Hình 2, Bảng 2 cho thấy dung dịch chứa hạt nano đồng tổng hợp (4) có khả năng ức chế khuẩn Xanthomonas sp. với đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 7.13 mm, các mẫu đối chứng là: (1) Đối chứng âm (nước cất khử trùng); (2) Đối chứng dương 1 (dịch chiết ly trích từ thực vật); (3) Đối chứng dương 2 (Dung dịch Cu2+ được sử dụng tạo nano đồng) không có khả năng ức chế khuẩn Xanthomonas sp.

4. Kết luận

Hạt nano đồng tổng hợp có dạng hình cầu, kích thước từ 5nm - 20nm.

Dung dịch chứa hạt nano đồng cho khả năng ức chế mạnh nấm Collectotrichum spp. so với các mẫu đối chứng. Phần trăm ức chế của dung dịch chứa hạt nano đồng ở nồng độ 16000 (µL/L) đối với Collectotrichum spp. lên đến 74,50%. Đồng thời, dung dịch chứa hạt nano đồng có khả năng ức chế mạnh khuẩn Xanthomonas sp. với đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 7.13 mm n

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

  1. Vũ Bá Quang (2016), Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Kế Sách tỉnh Sóc Trăng, chuyên mục kết quả nghiên cứu được viết ngày 27/8/2016.
  2. Vi Thị Thanh Hường, (2005), Nghiên cứu tác nhân và biện pháp phòng trừ bệnh loét trên cây bưởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu - tỉnh Đồng Nai, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
  3. Ya-Nan Chang et al. (2012). The Toxic Effects and Mechanisms of CuO and ZnO Nanoparticles, Materials, 5(12), 2850-2871.
  4. R. Betancourt-Galindo et al. (2014). Synthesis of Copper Nanoparticles by Thermal Decomposition and Their Antimicrobial Properties. Journal of Nanomaterials, Article ID 980545. https://doi.org/10.1155/2014/980545.
  5. Veronica Sáez and Timothy J. Mason. (2009). Sonoelectrochemical Synthesis of Nanoparticles. Journal of Molecules, 14(10), 4284-4299.
  6. N. Sivashankar et al. (2016). Particle Characterization of Copper Nanoparticles by Electrochemical Method. IJSTE - International Journal of Science Technology & Engineering, 3(01), 262-266.
  7. Appu Manikandan and Muthukrishnan Sathiyabama. (2015). Green Synthesis of Copper - Chitosan Nanoparticles and Study of its Antibacterial Activity. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology, 6(1), 251. doi: 10.4172/2157-7439.1000251.
  8. H. C. Ananda Murthy. (2018). A Review on Green Synthesis and Applications of Cu and CuO Nanoparticles, Material Science Research Indi, 15(3), 279-295
  9. Nguyễn Thị Dung (2014), Nghiên cứu tổng hợp nano đồng từ dung dịch Cu2+ bằng dịch chiếc nước lá bàng và ứng dụng làm chất kháng khuẩn, luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành hóa hữu cơ - Trường Đại học Đà Nẵng.
  10. Phan Thị Hồng Thảo và cộng sự. (2017), Tiềm năng ứng dụng nano bạc và đồng ức chế nấm Penicillium digitatum gây bệnh mốc xanh trên cam Việt Nam, Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tập 33, Số 1S (2017), 329-336.
  11. Đỗ Trung Đàm (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, Viện Dược liệu, Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

A STUDY ON THE GREEN METHOD AND THE COPPER

NANOPARTICLES’ RESISTANCE TO XANTHOMONAS SP.

AND COLLETOTRICHUM SPP.

• PHAM AN DUONG KHANG

• NGUYEN THI THU HA

• NGUYEN NGOC TRAI

• NGUYEN THIEN THAO

Tra Vinh University

ABSTRACT:

Copper nanoparticles (CuNPs) which are used in many fields such as antibacterial and antifungies have attracted considerable attention from scientists. In this study, CuNPs were synthesized by using the green method. The leaf extracts of Terminalia catappa L. were used as the reducing agent in Copper nitrate solution. The CuNPs generated in the reaction solution were characterized by UV-Vis spectrophotometry and Transmission electron microscopy (TEM) to evaluate their resistance to Xanthomonas sp. and Colletotrichum spp. This study’s results show that the CuNPs’ size were from 5 to 20 nm. The synthesized CuNPs solution is resistant to both Xanthomonas sp. and Colletotrichum spp.

Keywords: Terminalia catappa L., Xanthomonas sp, Colletotrichum spp, copper nanoparticles.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 18, tháng 8 năm 2020]