Đánh giá khả năng kháng khuẩn của hạt nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết từ lá huyết dụ

ThS. VÕ THỊ LAN HƯƠNG (Trường Đại học Công nghiệp Dệt May Hà Nội, NCS. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội) - TS. NGUYỄN NGỌC THẮNG (Trường Đại học Bách khoa Hà Nội)

TÓM TẮT:

Nano bạc được tổng hợp từ dung dịch bạc nitrat có sử dụng dịch chiết từ lá Huyết dụ Việt Nam làm chất khử đồng thời làm chất ổn định hạt nano bạc trong quá trình phản ứng. Đặc tính của hạt nano bạc được xác định bằng các phương pháp phân tích hiện đại bao gồm UV-Vis, TEM và FT-IR. Kết quả phân tích UV-Vis cho thấy xuất hiện bước sóng hấp thụ cực đại tại 470 nm chứng tỏ sự hình thành các hạt nano bạc. Ảnh TEM cho biết các hạt nano bạc có dạng hình cầu với đường kính khoảng 20 - 40 nm và kích thước hạt khá đồng đều. Phân tích FT-IR chứng minh sự có mặt của các nhóm chức có trong các hợp chất chiết từ là Huyết dụ tham gia vào phản ứng tổng hợp nano bạc. Nano bạc tạo thành có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm gram âm Escherichia coli và gram dương Staphylococcus aureus.

Từ khóa: Tổng hợp hóa học xanh, Huyết dụ, Nano bạc, Kháng khuẩn.

1. Đặt vấn đề

Hiện nay, nano bạc là một trong những vật liệu nano thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học và doanh nghiệp nhờ vào những đặc tính hóa học, vật lí và sinh học đặc biệt của nó [1, 2]. Do có các đặc tính ưu việt này nên nano bạc được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như quang điện tử, nhiếp ảnh, xúc tác, mỹ phẩm, y học, dệt may... [2, 3]. Nhiều công trình đã tập trung nghiên cứu tổng hợp nano bạc bằng các phương pháp khác nhau như phương pháp “top-down” bao gồm nổ điện, tia năng lượng cao, ăn mòn laze, nghiền cơ học, phương pháp khắc hóa học...; hoặc phương pháp “bottom-up” bao gồm ngưng tụ nguyên tử, lắng đọng hơi hóa học, sol-gel, dung dịch lỏng siêu tới hạn... [1-4]. Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp nêu trên đều có ít nhiều hạn chế, hoặc phải sử dụng các trang thiết bị hiện đại, phức tạp, hoặc phải dùng các hóa chất đắt tiền, không thân thiện với môi trường. Vì vậy, nhu cầu về việc tìm ra một phương pháp tổng hợp nano bạc mới có tính thân thiện với môi trường, đồng thời kinh tế hơn là một thách thức đối với các nhà khoa học.

Gần đây, các nhà khoa học đang nghiên cứu và phát triển phương pháp tổng hợp nano bạc mới theo con đường hóa học xanh, sử dụng các hoạt chất có trong dịch chiết từ thực vật, tảo, vi khuẩn, nấm, men để làm tác nhân khử và chất ổn định trong tổng hợp nano bạc [3, 5, 6]. Phương pháp tổng hợp này đang cho thấy nhiều ưu điểm là chi phí thấp, thân thiện với môi trường, không sử dụng nguồn năng lượng cao, không sử dụng các hóa chất độc hại và có thể tổng hợp quy mô lớn [3]. Một số nghiên cứu cho thấy trong dịch chiết từ thực vật thường chứa các hợp chất polyphenol, alkaloid, axit béo, protein... đóng vai trò là chất khử và chất ổn định bảo vệ các hạt nano bạc [5, 6].

Cây Huyết dụ, tên khoa học Cordyline fruticosa, là cây thân thảo với lá màu đỏ tía hoặc xanh sẫm được trồng nhiều nơi ở nước ta để trang trí và làm thuốc [7, 8]. Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá Huyết dụ chứa các hợp chất anthocyanin, saponin, flavonoid, flavonol, chlorophyll, glucoside,... trong đó anthocyanin là thành phần chính của lá Huyết dụ đỏ [7, 8]. Các hợp chất này đều có khả năng khử ion bạc để tạo thành nano bạc. Trên thế giới và trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng dịch chiết từ lá cây để tổng hợp nano bạc nhưng chưa có công bố nào sử dụng dịch chiết từ lá Huyết dụ để tổng hợp. Do vậy, nghiên cứu này sẽ khảo sát khả năng tổng hợp nano bạc của dịch chiết từ lá Huyết dụ Việt Nam và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc đối với 2 chủng vi khuẩn thông dụng là Escherichia coli và Staphylococcus aureus.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Lá Huyết dụ được thu hoạch ở Đông La, Hoài Đức, Hà Nội vào tháng 10/2019. Lá được chọn có màu đỏ, không bị sâu bệnh, được rửa sạch bằng nước cất và sấy khô ở 60oC trong 48 giờ. Lá khô được cắt nhỏ với kích thước khoảng 5×5 mm và bảo quản trong túi nhựa kín trước khi chiết. Bạc nitrat (AgNO3, 99,99%) được cung cấp bởi Công ty THNN Công nghệ hóa chất sinh học Aladdin, Trung Quốc. Dung môi sử dụng trong các thí nghiệm là nước cất 2 lần. Chủng vi khuẩn gram âm Escherichia coli (E. coli, ATCC 8739) và gram dương Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC25923) được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Các thí nghiệm và phân tích được thực hiện tại Trung tâm thí nghiệm Vật liệu Dệt may - Da giày, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, và Viện Kỹ thuật nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

a. Quy trình chiết hoạt chất từ lá Huyết dụ

Hình 1: Quy trình chiết hoạt chất từ lá Huyết dụ và xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết

Quy trình chiết hoạt chất từ lá Huyết dụ và xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết

Trong nghiên cứu này, tác giả lựa chọn phương pháp ninh chiết trong dung môi nước để chiết hoạt chất từ lá Huyết dụ vì quy trình đơn giản, kinh tế và thu được hàm lượng anthocyanin cao. Quy trình chiết hoạt chất từ lá Huyết dụ và xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết được trình bày trong Hình 1. Mẫu lá Huyết dụ khô, cắt nhỏ được đun trong nước cất ở nhiệt độ sôi, trong 10 phút với dung tỷ 1:20 (g lá khô/mL nước cất). Sau khi để nguội, lọc qua lưới để thu lấy dịch chiết. Dịch chiết sau đó được lọc tiếp 2 lần bằng giấy lọc Whatman #1 để loại hết chất rắn lơ lửng trong dịch chiết. Một phần dịch chiết được sấy khô để phân tích FT-IR; một phần để xác định hàm lượng anthocyanin. Phần còn lại dùng để tổng hợp nano bạc.

b. Quy trình tổng hợp nano bạc

Hình 2: Sơ đồ quy trình tổng hợp nano bạc từ bạc nitrat và dịch chiết lá Huyết dụ

Sơ đồ quy trình tổng hợp nano bạc từ bạc nitrat và dịch chiết lá Huyết dụ

Để tổng hợp nano bạc, dung dịch chiết từ lá Huyết dụ được pha loãng đến nồng độ 10 mg/L anthocyanin trước khi cho phản ứng với dung dịch bạc nitrat. Một số thí nghiệm sơ bộ được tiến hành để xác định điều kiện phản ứng thích hợp. Quy trình tổng hợp nano bạc từ bạc nitrat sử dụng dịch chiết lá Huyết dụ làm tác nhân khử được trình bày trong Hình 2. Lấy 1 ml dung dịch bạc nitrat 14mM thêm vào ống falcon chứa 10 ml dung dịch Huyết dụ có nồng độ anthocyanin 10 mg/L rồi tiến hành phản ứng ở 60oC và trong bóng tối. Sau 6 giờ phản ứng, các mẫu ngay lập tức được ly tâm và rung siêu âm 2 lần để loại bỏ các chất phản ứng còn dư và thu được dung dịch keo nano bạc. Điều kiện ly tâm bao gồm tốc độ 15.000 vòng/phút, trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 5oC, trên máy ly tâm R112805 Tomy MX-305, Nhật Bản. Điều kiện rung siêu âm ở tần số 37 kHz, nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút trên máy siêu âm UT-106H của hãng Sharp, Nhật Bản.

2.3. Các phương pháp phân tích

Hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết lá Huyết dụ được xác định bằng phương pháp pH vi sai theo tiêu chuẩn TCVN 11028:2015.

Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của dung dịch chiết và dung dịch keo nano bạc được xác định trên thiết bị UV1800 của hãng Shimadzu.

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEOLJEM-2100) sử dụng để phân tích đặc tính kỹ thuật của hạt nano bạc bao gồm hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt.

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR 6700 RX Raman Module Thermo Nicolet) được sử dụng để xác định các nhóm chức có trong dịch chiết lá Huyết dụ.

Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp xanh (AgCol) được đánh giá với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm E. coli và gram dương S. aureus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo tiêu chuẩn của viện CLSI [9]. Theo đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách xác định vùng ức chế vi sinh vật (ZOI) theo công thức (1).

                   ZOI (mm) = D - d    (1)

trong đó: D: đường kính vùng ức chế, (mm), d: đường kính giếng thạch (mm).

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết lá Huyết dụ

Các nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết lá Huyết dụ chứa các hợp chất anthocyanin, saponin, flavonoid, flavonol, chlorophyll, glucoside... [7, 8]. Hàm lượng và tỉ lệ các chất thu được trong dịch chiết tùy thuộc vào loài, thổ nhưỡng, thời điểm thu hoạch, phương pháp chiết… [8]. Với phương pháp ninh chiết trong dung môi nước, anthocyanin là thành phần chính của dịch chiết lá Huyết dụ màu đỏ. Nghiên cứu này sẽ xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết lá Huyết dụ để làm căn cứ xác định tỉ lệ các chất trong phản ứng tổng nano bạc.

Hình 3: Phổ UV-Vis của (a) dịch chiết lá Huyết dụ ở pH 1,0 và 4,5; (b) dung dịch nano bạc (AgCol) và dịch chiết lá Huyết dụ (Col)

 bạc (AgCol) và dịch chiết lá Huyết dụ (Col)

Hàm lượng anthocyanin được xác định bằng phương pháp pH vi sai, sử dụng 2 dung dịch đệm có pH =1 (KCl + HCl) và pH = 4,5 (KHC8H4O4 + HCl). Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của anthocyanin trong dịch chiết ở pH = 1 và pH = 4,5 trình bày trên Hình 3a cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại của anthocyanin trong lá Huyết dụ là 519 nm. Tính theo tiêu chuẩn TCVN 11028:2015 thu được hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết lá Huyết dụ là 109,72 ± 0,63 mg/L.

3.2. Tổng hợp nano bạc theo phương pháp hóa học xanh

Dịch chiết từ lá Huyết dụ được pha loãng đến nồng độ 10 mg/L anthocyanin trước khi cho phản ứng với dung dịch bạc nitrat. Sự hình thành hạt nano bạc có thể quan sát được thông qua sự đổi màu dung dịch phản ứng hoặc bằng các phân tích hiện đại như đo phổ UV-Vis, chụp ảnh TEM, phổ FT-IR… [3]. Trong nghiên cứu này, khi phản ứng xảy ra, dung dịch chuyển từ vàng nhạt sang màu nâu đỏ và cường độ màu tăng dần theo thời gian chứng tỏ có sự hình thành nano bạc [5, 6]. Quan sát phổ UV-Vis (Hình 3b) của dịch chiết lá Huyết dụ (Col) ta thấy không xuất hiện peak trong khoảng bước sóng 300-700 nm, trong khi dung dịch nano bạc sau khi tinh chế (AgCol) xuất hiện peak tại bước sóng 470 nm. Theo các tài liệu nghiên cứu về nano bạc, peak xuất hiện tại bước sóng 470 nm là sự cộng hưởng bề mặt plasmon của các hạt nano bạc hình cầu, có kích thước nhỏ hơn 40 nm [3, 5, 6]. Đỉnh hấp thụ cực đại trong phổ UV-Vis càng nhọn thì sự phân bố kích thước hạt càng tập trung, tức là các hạt nano bạc càng đồng đều về kích thước. Đây là một minh chứng về sự hình thành hạt nano bạc và điều này cho thấy các hợp chất có trong dịch chiết lá Huyết dụ như anthocyanin, saponin,... có khả năng khử ion bạc thành nano bạc.

Hình 4: Ảnh TEM của nano bạc với độ phóng đại (a) x 200.000 lần và (b) x 500.000 lần

nh TEM của nano bạc với độ phóng đại (a) x 200.000 lần và (b) x 500.000 lần

Để xác định hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước của các hạt nano bạc, ảnh TEM chụp mẫu nano bạc sau khi tinh chế được thực hiện và kết quả trình bày trong Hình 4. Ta thấy các hạt nano bạc đều có dạng hình cầu với đường kính hạt trung bình khoảng 20 - 40 nm. Kết quả này phù hợp với nhận định trong phân tích UV-Vis. Ngoài ra, quan sát ảnh với độ phóng đại lớn x500.000 lần (Hình 4b) cho thấy rõ cấu trúc đa tinh thể của hạt nano bạc tổng hợp được. Đây là dạng cấu trúc thường gặp khi tổng hợp nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết từ thực vật [3].

Hình 5: Phổ FT-IR của dịch chiết lá Huyết dụ

Phổ FT-IR của dịch chiết lá Huyết dụ

Kết quả phân tích FT-IR với mẫu cô đặc từ dịch chiết lá Huyết dụ được trình bày trên Hình 5 cho thấy sự xuất hiện của các peak tại số sóng 3261,82 cm-1 đặc trưng cho các nhóm chức hydroxyl (O-H); tại 2925,62 cm-1 đặc trưng cho nhóm ankyl (C-H) trong mạch hydrocacbon; tại 1592,59 cm-1 đặc trưng cho liên kết cacbonyl (C=O) trong nhóm chức este hoặc xeton. Các peak tại số sóng 1394,86 cm-1 và 1038,97 cm-1 tương ứng với các liên kết C-O và C-O-C trong các hợp chất anthocyanin, flavonoid, saponin… [7, 8]. Các nhóm chức này của các hợp chất hữu cơ chiết từ lá Huyết dụ dễ bị oxi hóa, đóng vai trò là chất khử trong phản ứng tổng hợp nano bạc. Đồng thời các hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết cũng là chất ổn định, ngăn cản sự kết tụ các hạt nano bạc [3].

3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano bạc

Hình 6: Vùng ức chế của nano bạc tổng hợp xanh (AgCol) với (a) E. coli, và (b) S. aureus: chứng âm (H2O); chứng dương Cloramphenicol (Clp, 200 μg/mL); AgCol (240 μg/mL); 1/2AgCol (120 μg/mL) và 1/4AgCol (60 μg/mL)

Vùng ức chế của nano bạc tổng hợp xanh (AgCol) với (a) E. coli, và (b) S. aureus: chứng âm (H2O); chứng dương Cloramphenicol (Clp, 200 μg/mL); AgCol (240 μg/mL); 1/2AgCol (120 μg/mL) và 1/4AgCol (60 μg/mL)

Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc tổng hợp xanh AgCol với các nồng độ (240, 120 và 60 μg/mL) được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch với các chủng vi khuẩn gây bệnh gram âm E. coli và gram dương S. aureus. Hoạt tính kháng khuẩn của AgCol được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, thông qua độ rộng của vùng ức chế vi khuẩn tạo ra trên đĩa Petri, được thể hiện trong Hình 6 và Bảng 1. Trên Hình 6 cho thấy với chứng âm là nước cất (H2O) không xuất hiện vùng ức chế, trong khi chứng dương là kháng sinh Cloramphenicol 200 μg/mL (Clp) có vùng ức chế vi khuẩn rộng với cả 2 chủng khuẩn thử nghiệm. Hiệu quả kháng khuẩn của AgCol đối với E.coli và S. aureus rất tốt với độ rộng vùng ức chế ở nồng độ thấp nhất đạt tương ứng là 7,6 ± 0,46 và 4,8 ± 0,53 mm. Cơ chế kháng khuẩn của các hạt nano bạc được giải thích là do chúng có kích thước nhỏ nên diện tích bề mặt riêng lớn, dễ dàng thâm nhập qua màng tế bào vi khuẩn, giải phóng ra ion bạc, liên kết với các phân tử trong vi khuẩn, thực hiện các phản ứng oxy hóa, sinh ra các gốc tự do ức chế sự phát triển của vi khuẩn [2, 5, 6].

Bảng 1. Vùng ức chế vi khuẩn E. coli và S. aureus của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá Huyết dụ

ùng ức chế vi khuẩn E. coli và S. aureus của nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá Huyết dụ

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, nano bạc đã được tổng hợp từ muối bạc nitrat với tác nhân khử là các hợp chất có trong dịch chiết lá Huyết dụ Việt Nam. Điều kiện phản ứng tổng hợp nano bạc bao gồm: dung tỷ chiết lá Huyết dụ trong nước cất là 1:20 và dịch chiết sau đó được pha loãng đến nồng độ 10 mg/L anthocyanin; nồng độ bạc nitrat 14 mM, phản ứng ở nhiệt độ 60oC, thời gian 6 giờ và trong bóng tối. Các kết quả phân tích UV-Vis và TEM cho thấy hạt nano bạc tổng hợp được có dạng hình cầu, đường kính hạt khoảng 20 - 40 nm. Phân tích FT-IR cho thấy các hợp chất hữu cơ trong dịch chiết lá Huyết dụ đã đóng vai trò là chất khử và chất ổn định trong phản ứng tổng hợp nano bạc. Kết quả nghiên cứu cho thấy nano bạc tổng hợp được có hoạt tính kháng khuẩn tốt với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh là E. coli và S. aureus. Kết quả này mở ra khả năng ứng dụng nano bạc tổng hợp xanh cho các sản phẩm dệt may và da giày có chức năng kháng khuẩn.

Lời cảm ơn:

Tác giả xin cảm ơn sự giúp đỡ của Viện Dệt may - Da giầy và Thời trang, Đại học Bách khoa Hà Nội và sự hỗ trợ tài chính của Trường Đại học Công nghiệp Dệt May Hà Nội với đề tài có mã số 09.2020/HĐ.NCKH.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

  1. Iravani S, et al.: Synthesis of silver nanoparticles: chemical, physical and biological methods. Res Pharm Sci 2014, 9(6):385-406.
  2. Lee SH, Jun B-H: Silver Nanoparticles: Synthesis and Application for Nanomedicine. International Journal of Molecular Sciences 2019, 20(4).
  3. Abdelghany TM, etal.: Recent Advances in Green Synthesis of Silver Nanoparticles and Their Applications: About Future Directions. A Review. BioNanoScience 2018, 8(1):5-16.
  4. Nguyen N-T, Liu J-H: A green method for in situ synthesis of poly (vinyl alcohol)/chitosan hydrogel thin films with entrapped silver nanoparticles. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 2014, 45(5):2827-2833.
  5. Thi Lan Huong V, Nguyen NT: Green synthesis, characterization and antibacterial activity of silver nanoparticles using Sapindus mukorossi fruit pericarp extract. Materials Today: Proceedings 2020 (In press).
  6. Vu TH, Bui VH, Nguyen NT: Antibacterial Properties of Silver Nanoparticles Synthesized Using Piper betle L. Leaf Extract. Materials Science Forum 2021, 1020:236-242.
  7. Nguyen NT, Hoang TTL: Optimization of ultrasound-assisted extraction of natural colorant from Huyet du leaves using ethanol solvent. Journal of Science and Technology-HaUI 2019, 51:5.
  8. Lim TK: Cordyline fruticosa. In Edible Medicinal and Non Medicinal Plants: Volume 9, Modified Stems, Roots, Bulbs. Edited by Lim TK. Dordrecht: Springer Netherlands; 2015: 627-632.
  9. Clinical, Institute LS: Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A7 2006, 26.

INVESTIGATING ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SILVER

NANOPARTICLES PREPARED BY GREEN SYNTHESIS USING

CORDYLINE FRUTICOSA LEAF EXTRACT

• MSc. VO THI LAN HUONG

Hanoi Industrial Textile Garment University

PhD. Student in Hanoi University of Science and Technology

• PhD. NGUYEN NGOC THANG*

Hanoi University of Science and Technology

ABSTRACT:

The silver nanoparticles are synthesized by treating an aqueous silver nitrate solution with Vietnam Cordyline fruticose leave extract, which acts as a reductant and a stabilizer simultaneously. The synthesized silver nanoparticles are examined by UV-Vis spectroscopy, transmission electron microscope (TEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The observation of the peak at 470 nm in the UV-Vis spectrum for the obtained silver nanoparticles reveals the reduction of silver metal ions into silver nanoparticles. The TEM denotes the presence of spherical silver nanoparticles with diameter about 20 - 40 nm, and the unique size-distribution. The FT-IR analysis is performed to identify the possible functional groups involved in the green synthesis of silver nanoparticles. The silver nanoparticles also exhibite effective antibacterial activities against both gram-negative (Escherichia coli) and gram-positive (Staphylococcus aureus) microorganisms.

Keywords: Green synthesis, Cordyline fruticosa, silver nanoparticles, antibacterial activity.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 28, tháng 11 năm 2020]