Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của bọt biển protein

TÓM TẮT:

Bài báo nghiên cứu về hoạt tính sinh học protein của hai loại bọt biển Haliclona fascigera và Clathria reinwardti. Các dịch chiết protein được tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn. Phân lập phần protein được thực hiện bằng cách sử dụng dung môi phân cực (dung dịch đệm Tris-HCl 0,1 M). Quá trình tinh chế protein được thực hiện bằng phương pháp phân đoạn bằng cách sử dụng amoni sulfat, sau đó thẩm tách và cuối cùng việc xác định hàm lượng protein được thực hiện bằng phương pháp Lowry. Các xét nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bao gồm phương pháp khuếch tán bằng cách sử dụng đĩa giấy. Kết quả cho thấy protein từ bọt biển Clathria reinwardtii (phân đoạn 0-20%) và bọt biển Haliclona fascigera (phân đoạn 20-40%) có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli, nhưng không hiệu quả như các chất kháng khuẩn mới.

Từ khóa: Haliclona fascigera, Clathria reinwardtii, Protein, độc tính, kháng khuẩn.

1. Đặt vấn đề

Bọt biển là một nguồn cung cấp các hợp chất tiềm năng mới. Nhiều nghiên cứu của bọt biển đã tạo ra các hợp chất mới có cấu trúc độc đáo và các hoạt động dược như kháng khuẩn, chống viêm, kháng sinh.

Nghiên cứu trước đây, hợp chất chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy trong một số loài bọt biển, hợp chất này hoạt động như một chất kháng khuẩn, nó đã được chiết xuất bằng dung môi không phân cực (chloroform), nhưng từ một số loài bọt biển khác không cho thấy hoạt tính kháng khuẩn. Những kết quả này đã gợi ý một số hợp chất khác tích cực giống như protein, nó được tạo ra trong cơ thể của miếng bọt biển như một chất kháng khuẩn, do đó miếng bọt biển vẫn có thể phát triển và phát triển tốt ở biển, mặc dù vi khuẩn bị phá vỡ.

Nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của hoạt tính protein hoạt tính sinh học từ bọt biển như protein bọt biển ở dạng kháng khuẩn và ở dạng kháng virus. Protein như một loại thuốc kháng khuẩn có các ưu điểm như khả năng chấp nhận tốt mà không có tác dụng phụ. Bên cạnh đó, các gen protein có thể được tách dòng, được sản xuất hàng loạt trên quy mô công nghiệp thông qua các kỹ thuật công nghệ di truyền.

Trong nghiên cứu này, phần protein bọt biển phân lập được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn. Từ nghiên cứu này, dự kiến sẽ tạo ra kiến thức mới về các thành phần của protein hoạt tính sinh học bọt biển, có thể được sử dụng làm thành phần thuốc mới.

2. Tiến hành thí nghiệm

Vật liệu

Các vật liệu được sử dụng là bọt biển Haliclona  fascigera và Clathria reinwardtii, môi trường nuôi cấy tinh khiết của Staphylococcus aureus và Escherichia coli, Artemia salina Leach, dung dịch đệm A (Tris-HCl 0.1 M pH 8.3; NaCl 2M; CaCl2 0.01M; β- mercaptoetanol 1% Triton X- 100 0.5%) dung dịch đệm B (Tris-HCl 0.1M pH 8.3; NaCl 2M; CaCl2 0.01M), dung dịch đệm C (Tris-HCl 0.01M pH 8.3, NaCl 0.2M, CaCl2 0.01M), Ammonium sulphate (Merck), Lowry A, Lowry B, Albumine Bovine Serum (BSA) 4 mg/mL, chloramphenicol, cát biển, nước biển, lá nhôm, 70% cồn, cuộn mô, đĩa giấy và nước cất.

Lấy mẫu và nhận dạng

Các mẫu bọt biển được thu thập thủ công gần biển. Nó được rửa bằng nước biển cho đến khi sạch, được đưa vào các mẫu nhựa, được dán nhãn địa điểm và ngày tháng, sau đó được đưa đến phòng thí nghiệm.

Phân lập protein

Bọt biển được thu thập được cắt thành từng miếng nhỏ, được đồng nhất bằng máy trộn với dung dịch đệm A và sau đó được lọc. Nước lọc được làm đông lỏng 2-3 lần và sau đó ly tâm ở 4500 vòng/phút 4°C trong 20 phút. Dịch nổi trên mặt được bảo quản trong tủ lạnh và sau đó tiến hành ở giai đoạn tiếp theo. Protein chiết xuất thô được phân đoạn bằng cách sử dụng amoni sulfat ở độ bão hòa: 0-20%, 20-40%, 40-60% và 60-80% và sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút. Các phân đoạn protein được đựng trong túi giấy bóng kính, được đựng trong dung dịch đệm B sau đó chúng được khuấy bằng máy khuấy từ. Quá trình thẩm tách đã tiếp tục với dung dịch đệm C và dừng lại cho đến khi dung dịch đệm không có màu.

Xét nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Chất ức chế protein có hoạt tính sinh học được sử dụng trong phương pháp khuếch tán thạch. Xét nghiệm ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Thí nghiệm đã tiệt trùng bằng các nồi hấp 121°C, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ 40°C - 45°C. Sau đó, môi trường 15mL được rót vô trùng vào đĩa petri và kết hợp vi khuẩn huyền phù 0,2mL. Bảy đĩa giấy đã là hợp chất thử nghiệm hỗn hợp. Các đĩa giấy đã được đặt trên bề mặt của nó. Đĩa petri đã ủ trong 24-48 giờ ở 37°C và sau đó quan sát vùng kháng thuốc.

3. Kết quả thí nghiệm

Kết quả hàm lượng protein cho thấy chiết xuất thô của Haliclona fascigera là 17,23 mg/mL với tổng lượng protein 9892,32 mg và Clathria reinwardtii là 15,67 mg/mL với tổng lượng protein 8617,56 mg. Mẫu phân bố protein trong mỗi phân đoạn được thể hiện ở Bảng dưới đây: (Xem Bảng)

Bảng. Mô hình phân bố protein ở các mức độ bão hòa khác nhau (NH4)2SO4

của 2 loại bọt biển

Từ những thông số ở Bảng cho thấy, nồng độ protein của hai loài bọt biển khác nhau ở mỗi phần. Có thể do sự khác biệt về độ hòa tan của protein trong nước, các protein có độ hòa tan thấp hơn được kết tủa trước so với các protein có độ hòa tan cao hơn. Sự khác biệt về độ hòa tan gây ra sự cạnh tranh giữa các protein với muối amoni sulfat trong việc gắn kết các dung môi protein. Các protein ít gắn kết với dung môi trong quy trình phân đoạn, sau đó protein lắng xuống, sao cho phân đoạn có nồng độ protein cao nhất là protein có độ hòa tan trong nước thấp. Nồng độ protein cao nhất của bọt biển Haliclona fascigera được tìm thấy trong phần 20-40% của 31,16 mg/mL và trong bọt biển Clathria reinwardtii được tìm thấy trong phần 0-20% của 31,22 mg/mL. Những dữ liệu này đã biết, protein Haliclona fascigera sponge có độ hòa tan trong nước cao hơn protein từ Clathria reinwardtii sponge.

Hai vi khuẩn được sử dụng để thử nghiệm kháng khuẩn, đó là vi khuẩn gram âm Escherichia coli và vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus, gây bệnh ở người. Thử nghiệm ức chế protein có hoạt tính sinh học đối với sự phát triển của vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp khuếch tán thạch bằng cách sử dụng đĩa giấy.

Hoạt tính sinh học Protein kháng khuẩn phân đoạn của Haliclona fascigera

Các kết quả của vùng ức chế phần protein của miếng bọt biển Haliclona fascigera trên 2 vi khuẩn, sau 24 và 48 giờ thời gian ủ, tất cả các mẫu bọt biển được nghiên cứu có chứa các hợp chất protein có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

Hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong thời gian ủ 24 giờ được tìm thấy ở tỷ lệ 20-40% với diện tích vùng ức chế 14,56mm đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus và 14,25mm đối với vi khuẩn Escherichia coli. Sau 48 giờ ủ, không có sự gia tăng vùng ức chế đối với E. coli hoặc S. aureus, tuy nhiên sự ức chế ở vùng này giảm. Sự giảm này cho thấy protein hoạt tính sinh học có trong miếng bọt biển Haliclona fascigera có tính kìm hãm vi khuẩn. Theo Wattimmena, chất kháng khuẩn được coi là kháng khuẩn nếu chất kháng khuẩn có hiệu quả ức chế sự phát triển của vi khuẩn nhưng không tiêu diệt vi khuẩn cho đến trong vòng 48 giờ ưu điểm như khả năng chấp nhận tốt mà không có tác dụng phụ. Bên cạnh đó, các gen protein có thể được tách dòng, được sản xuất hàng loạt trên quy mô công nghiệp thông qua các kỹ thuật công nghệ di truyền.

Hoạt tính sinh học Protein kháng khuẩn Phân đoạn của Clathria reinwardtii

Hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong thời gian ủ 24 giờ là ở mức 0-20% với vùng ức chế là 14,94mm đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus và 14,35mm đối với vi khuẩn Escherichia coli. Sau 48 giờ, không có sự gia tăng vùng ức chế đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus, điều này có nghĩa là phần protein này là kìm hãm vi khuẩn. Vùng ức chế vi khuẩn Escherichia coli trên dịch chiết thô và phân đoạn được phát hiện là 60-80%. Điều này thể hiện phần hợp chất protein có hoạt tính sinh học 60-80% và dịch chiết thô là diệt khuẩn, thuật ngữ diệt khuẩn được định nghĩa là vi khuẩn tiêu diệt vật liệu. Thuốc diệt vi khuẩn thường ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kích thích thành tế bào, kết tụ protein vi khuẩn do sự khác biệt về độ axit, cũng như sự thủy phân và khuếch tán sâu răng tế bào gây ra sự khác biệt về áp suất thẩm thấu. Vùng ức chế của phân đoạn protein và dịch chiết thô của hai mẫu bọt biển được thử nghiệm với Staphylococcus aureus và Escherichia coli, không có phân đoạn nào vượt quá vùng ức chế của đối chứng dương (chloramphenicol). Hoạt tính ức chế các phân đoạn protein chống lại vi khuẩn gây bệnh là nhỏ, có thể do nồng độ phân đoạn protein rất thấp hoặc do vi khuẩn gây bệnh kháng protein hoạt tính sinh học. Protein phân đoạn của bọt biển Clathria reinwardtii (phân đoạn 0-20%) và Haliclona fascigera (phân đoạn 20-40%) có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli.

Nhìn chung, các protein phân đoạn 0-20% từ bọt biển Clathria reinwardtii có hoạt tính mạnh nhất đối với cả hai loại vi khuẩn (vi khuẩn Staphylococcus aureus và Escherichia coli). Đây là phân đoạn kết tủa sớm nhất, vì vậy điều này cho thấy protein hoạt tính là protein có độ hòa tan nhỏ trong nước.

Tài liệu tham khảo:

Colowick SP, Kaplan NO. Methods in Enzymology, Vol I, New York (IDN) (1957). Academic Press Inc. Publisher.

Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL (1982). Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med; 45: 31-34.

Wattimena JR, (1991). Pharmacodynamics and antibiotic therapy. Yogyakarta (IDN): Gadjah Mada University Press.

A study on antibacterial activity of protein sponges

NGUYEN THI PHUONG LAN

Faculty of Applied Science, University of Economics - Technology for Industries

Abstract:

This study investigates the antibacterial activity of protein extracts derived from two marine sponges: Haliclona fascigera and Clathria reinwardti. Protein fractions were isolated using a 0.1 M Tris-HCl buffer, followed by ammonium sulfate precipitation and dialysis. Protein concentrations were quantified using the Lowry method. Antibacterial activity was assessed via the disk diffusion method against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The results demonstrated that the 0 - 20% protein fraction from Clathria reinwardti and the 20 - 40% fraction from Haliclona fascigera exhibited inhibitory effects against both bacterial strains. However, the level of activity was moderate and did not match the efficacy of contemporary antibacterial agents. These findings suggest potential but limited antibacterial properties of sponge-derived proteins, warranting further investigation.

Keywords: Haliclona fascigera, Clathria reinwardtii, protein, toxicity, antibacterial.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 13 năm 2025]