Để loại bỏ glucoza trong hỗn hợp dịch đường FOS phổ thông, có nhiều phương pháp, dựa trên những nguyên lý khác nhau, ví dụ như dùng enzim glucooxidaza để chuyển hoá đường glucoza thành gluconic axit [5]; dùng công nghệ lọc màng với kích cỡ màng phù hợp để tách glucoza; Lọc gel phân tách các cấu tử có trọng lượng phân tử khác nhau; Dùng vi sinh vật đặc chủng để lên men đồng hoá glucoza v.v… Dưới đây là một nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men để nâng cao độ tinh khiết của dịch đường FOS phổ thông.
II. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Giống vi sinh vật và nguyên liệu chính
- Các chủng giống nấm men từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm
- Dịch đường FOS phổ thông do Viện Công nghiệp thực phẩm cung cấp.
- Các hoá chất khác đều là loại tinh khiết và được mua tại thị trường trong nước.
Phương pháp
Phương pháp tuyển chọn giống vi sinh vật: Tuyển chọn dựa trên khả năng đồng hoá glucoza nhưng không đồng hoá đường FOS
Phương pháp lên men:
- Môi trường lên men cơ sở:
+ Đường glucoza: 7 %
+ Pepton : 1 %
+ Cao nấm men : 1 %
+ MgSO4 : 0,1 %
+ KH2PO4 : 0,1 %
+ Ure : 0,4 %
- Điều kiện lên men trên máy lắc: Bình tam giác dung tích 250 ml; lượng dịch 40 ml; Nuôi cấy trên máy lắc với tần số lắc là 200 vòng/phút; Nhiệt độ nuôi cấy 280 C; Thời gian nuôi cấy 24 giờ.
Xác định hàm lượng glucoza: Phương pháp DNS [ 5].
Phân tích thành phần đường: Dùng sắc ký lỏng cao áp HPLC [ 4 ].
III. Kết quả và thảo luận
1. Tuyển chọn giống nấm men
Để có thể loại bỏ đường glucoza trong dịch đường FOS phổ thông, ta cần phải tuyển chọn được chủng giống vi sinh vật đặc hiệu, có khả năng đồng hóa duy nhất một loại hydratcabon là glucoza. Vì thế, việc đầu tiên trong nghiên cứu này là tuyển chọn giống vi sinh vật.
Mười chủng nấm men từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp với tên gọi như liệt kê trong bảng 1 dưới đây được lên men trong điều kiện và môi trường giống nhau như sau:
Môi trường: Dịch đường FOS phổ thông có nồng độ chất khô là 22 %; pH môi trường được chỉnh về 6.0.
Điều kiện lên men: Lên men trên bình tam giác có dung tích 250 ml, mỗi tam giác chứa 50 ml môi trường, lên men ở nhiệt độ 280C trong thời gian 24 giờ với tốc độ lắc là 250 vòng/phút.
Kết thúc quá trình men, dịch lên men được đem đi phân tích hàm lượng đường FOS và đường glucoza có trong dịch bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC.
Kết quả được ghi nhận trên bảng 1.
Số liệu trên bảng 1 cho thấy, hầu hết các chủng nấm men trên đều có thể đồng hoá glucoza và FOS trong dịch đường FOS, tuy nhiên mức độ có khác nhau. Trong số các chủng trên, có chủng HB 1.3.13 là có khả năng đồng hoá đường glucoza cao nhất, vì lượng glucoza trong dịch giảm đi đáng kể từ 66,5 g/l xuống còn 6 g/l. Hơn thế nữa, khả năng đồng hoá đường FOS lại rất thấp, gần như không vì sau quá trình lên men bằng chủng này, lượng đường FOS trong dịch lên men chỉ giảm đi tý chút, tức là từ 112 g/l xuống còn 107 g/l. Đây chính là chủng giống mà nghiên cứu cần tìm. Ngoài chủng BN 1.3.13 ra, ta thấy chủng 7071 cũng có khả năng đồng hoá tương đối cao đường glucoza trong dịch đường FOS. Với kết quả trên, ta chọn chủng HB 1.3.13 làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2. Nghiên cứu lựa chọn thành phần môi trường lên men chủng HB 1.3.13 để thu nhận sinh khối
Để đạt hiệu quả cao trong quá trình nâng cao độ tinh khiết của đường FOS, việc lên men chủng HB 1.3.13 được tiến hành theo hai bước. Bước đầu tiên lên men để thu sinh khối trong điều kiện phù hợp với sự sinh trưởng của nấm men, bước hai dùng sinh khối nấm men trưởng thành thu được đó để đồng hoá đường glucoza trong dịch đường FOS.
2.1. ảnh hưởng của hàm lượng glucoza đến quá trình sinh trưởng của nấm men
Chủng HB 1.3.13 được chọn có khả năng đồng hoá glucoza, nên nguồn hydratcacbon chính được chọn ở đây là đường glucoza. Thí nghiệm để xác định hàm lượng glucoza thích hợp cho quá trình tạo sinh khối nấm men được thực hiện với các mẫu có cùng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cơ sở như đã ghi trong phần phương pháp nghiên cứu, chỉ khác nhau về hàm lượng glucoza trong khoảng 50 g/lít đến 110g/lít. Sau 24 giờ nuôi cấy, các mẫu được đem đi phân tích trọng lượng sinh khối hình thành. Kết quả phân tích được trình bày trên bảng 2.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm lượng đường glucoza trong môi trường lên men có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Hàm lượng đường glucoza thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nấm men là 70 g/lít.
2.2. ảnh hưởng của nguồn đạm đến sự sinh trưởng của nấm men
Nguồn đạm thông dụng cho lên men trong nghiên cứu vi sinh như peptone, ure, sunphat amon… đã được dùng làm đối tượng nghiên cứu để lựa chọn ra chủng loại và liều lượng thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng của nấm men. Các mẫu thí nghiệm với các chủng loại và liều lượng đạm như liệt kê trên bảng 3 được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện cơ sở như nhau. Sau quá trình nuôi cấy, lượng sinh khối tạo ra của các mẫu được đem đi đánh giá để xác định mức độ ảnh hưởng của nguồn đạm.
Số liệu trên bảng 3 cho thấy, nguồn đạm có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Nguồn đạm hữu cơ thể hiện tính ưu việt hơn nhiều so với nguồn đạm vô cơ, bởi do nguồn đạm vô cơ làm giảm giá trị pH của môi trường, ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Việc kết hợp hai loại đạm hữu cơ là pepton và ure theo tỷ lệ phối trộn 50/50 dường như thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng của chủng nấm men. Hàm lượng sinh khối khô thu được sau quá trình nuôi cấy cho giá trị cao nhất là 9,8g/lít.
2.3. ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến sự sinh trưởng của nấm men
Cao nấm men là nguồn dinh dưỡng quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật và đặc biệt cho các chủng nấm men. Trong thành phần hoá học của cao nấm men, ngoài lượng lớn protein ra, cao nấm men còn chứa rất nhiều loại vitamin và khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men. Vì thế, việc bổ sung cao nấm men vào môi trường nuôi cấy nấm men là cần thiết. Hàm lượng cao nấm men cho nuôi cấy các chủng nấm men khác nhau không giống nhau, nên phải lựa chọn tỷ lệ thích hợp. Quá trình thí nghiệm cũng được tiến hành với các mẫu có tỷ lệ cao nấm men khác nhau, từ 0,4 % đến 0,8 %. Lượng sinh khối khô tạo ra của các mẫu được trình bày trên bảng 4.
Số liệu cho thấy, lượng sinh khối khô thu được đạt giá trị cao nhất (10,2 g/lít) ở mẫu thí nghiệm số 3 với hàm lượng cao nấm men là 0,6 %. Các mẫu có hàm lượng cao nấm men cao hơn 0,6 % cho lượng sinh khối khô cao hơn chút ít, nhưng không đáng kể. Với kết quả trên, ta chọn tỷ lệ cao nấm men bằng 0,6 % cho quá trình lên men tạo sinh khối phục vụ cho nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của đường FOS bằng phương pháp lên men.
2.4. ảnh hưởng của nguồn khoáng đến quá trình sinh trưởng của nấm men
Để lựa chọn nguồn khoáng thích hợp, nghiên cứu được tiếp tục với các mẫu thí nghiệm với hai nguồn khoáng thông dụng trong lên men vi sinh vật là sunphát magiê và KH2PO4 với các tỷ lệ khác nhau như bảng 5 trình bày. Khả năng sinh trưởng của nấm men phụ thuộc vào nguồn và tỷ lệ khoáng được thể hiện trên bảng thông qua chỉ tiêu hàm lượng sinh khối tạo thành sau quá trình nuôi cấy 24 giờ ở điều kiện cơ sở. (Xem bảng 5)
Số liệu trên bảng 5 cho thấy ảnh hưởng của hai nguồn khoáng MgSO4 và KH2PO4 đến khả năng sinh trưởng của nấm men không nhiều, tuy nhiên khi sử dụng hỗn hợp hai nguồn khoáng trên ở tỷ lệ phối trộn là 1:1 và hàm lượng tổng hỗn hợp đó đạt giá trị 2 % sẽ cho lượng sinh khối khô trên một lít dịch lên men là cao nhất (10,6 g/lít).
3. Nghiên cứu xác định điều kiện lên men chủng HB 1.3.13 để thu nhận sinh khối
3.1. ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của nấm men
Nhiệt độ thường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của nấm men. Mỗi loại vi sinh vật có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ thích hợp. Vì thế việc xác định nhiệt độ cho quá trình nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm men là cần thiết. Cũng như các thí nghiệm khác, các mẫu được lên men trong cùng một môi trường có thành phần như đã tuyển chọn được trong các thí nghiệm trước ở các nhiệt độ khác nhau, từ 200C đến 340C. Kết thúc quá trình nuôi cấy, các mẫu được đem đi xác định hàm lượng sinh khối. Kết quả được trình bày trên bảng 6.
Kết quả trên bảng 6 cho thấy, nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng cúa nấm men. Khả năng sinh trưởng của chủng nấm men này khá tốt trong khoảng nhiệt độ 280C – 320C và tốt nhất là ở nhiệt độ 28 0C - 30 0C. Tại nhiệt độ nuôi cấy tối ưu này, hàm lượng sinh khối khô tính trên 1 lít môi trường lên men là 10,8 g.
3.2. ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình sinh trưởng của nấm men
pH của môi trường thường có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phát triển tốt trong môi trường axit và ngược lại, có những chủng lại phát triển tốt trên môI trường kiềm, cũng có rất nhiều chủng vi sinh vật lại phát triển tốt trên môi trường trung tính. Để thu được nhiều sinh khối cần thiết phải xác định pH môi trường thích hợp cho chủng giống nuôi cấy. Các mẫu thí nghiệm được tiến hành với các mẫu có thành phần môi trường giống nhau, nhưng khác nhau về độ pH được nuôi cấy trong điều kiện như nhau trên máy lắc 200 vòng /phút. Kết quả được liệt kê trong bảng 7.
Số liệu trên bảng 7 cho thấy sự khác biệt rất xa về khả năng sinh trưởng của nấm men ở những điều kiện pH khác nhau. Môi trường axit và kiềm mạnh không thích hợp cho quá trình sinh trưởng của chủng giống trên. Chúng chỉ phát triển mạnh trên môi trường kiềm yếu và đặc biệt thích hợp ở giá trị pH ban đầu bằng 6,0.
3.3. Động học sinh trưởng của chủng nấm men HB 1.3.13
Để khảo sát động học của quá trình sinh trưởng của chủng nấm men, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên bình lên men bán tự động 14 lít, với lượng dịch là 10 lít.
- Thành phần môi trường lên men đã được xác định ở các thí nghiệm trước như sau:
+ Đường glucoza: 7 %
+ Pepton: 0,75 %
+ Cao nấm men: 0,6 %
+ MgSO4: 0,1 %
+ KH2PO4: 0,1 %
+ Ure: 0,75 %
- Điều kiện lên men:
+ Nhiệt độ lên men: 30 0C
+ pH ban đầu: 6,0
+ Tốc độ khuấy: 250 vòng /phút
+ Tốc độ cấp khí: 0,5 lít/lít/phút
Theo dõi thí nghiệm trong suốt quá trình lên men lấy mẫu kiểm tra hàm lượng sinh khối sau giờ lên men thứ 4, mỗi mẫu cách nhau 2 giờ. Kết quả được trình bày trên đồ thị hình 1.
Từ đồ thị hình 1 ta thấy, sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men HB 1.3.13 tuân thủ quy luật chung với pha tiềm phát kéo dài 4 giờ. Trong thời gian này, sự thay đổi pH, oxy hòa tan là không đáng kể. Pha logarít bắt đầu từ 8 giờ đến thời điểm sinh khối tế bào đạt cực đại 13,9 g/l ở giờ lên men thứ 36. Trong giai đoạn này, ôxy hòa tan được tiêu thụ rất mạnh. pH tăng, giảm nhẹ trong khoảng giá trị 5,7 - 6,2. Pha cân kéo dài trong thời gian từ 36 giờ đến 42 giờ và pha suy vong bắt đầu sau 44 giờ nuôi cấy. Như vậy, với mục đích thu sinh khối, ta sẽ chọn thời điểm kết thúc lên men là 36 giờ.
4. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình đồng hoá glucoza trong dịch đường FOS phổ thông.
Sau khi thu nhận được sinh khối nấm men của chủng HB 1.3.13, việc nghiên cứu được tiếp tục bằng cách bổ sung chúng vào dịch đường FOS phổ thông để đồng hoá lượng glucoza có trong dịch, giảm thiểu lượng phụ phẩm không mong muốn này, nhằm nâng cao độ tinh khiết của đường FOS. Để quá trình xử lý đạt hiệu quả cao, việc xác định điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý là cần thiết.
4.1. ảnh hưởng của nồng độ đường FOS
Để xác định ảnh hưởng của nồng độ dịch đường ban đầu đến quá trình đồng hoá glucoza của chủng nấm men HB 1.3.13, chúng tôi đã tiến hành làm các mẫu thí nghiệm với các nồng độ đường khác nhau ở điều kiện xử lý như nhau là nhiệt độ 300C, pH 6,0, thời gian 30 giờ. Kết thúc quá trình xử lý, dịch đường được thu hồi và làm sạch. Hàm lượng đường trong dịch thu hồi sau đó được đem phân tích, kết quả được trình bày trên bảng 8.
Các số liệu trên bảng 8 cho thấy, ở nồng độ đường 200 g/l, hiệu suất đồng hoá glucoza trong dịch đạt giá trị cao nhất là 55,8 g/l. Với cách xử lý như vậy, hàm lượng đường FOS trong dịch được tăng từ 50 % lên 69,4 %.
4.2. ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối
Để đạt hiệu suất xử lý cao hơn, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện để xác định tỷ lệ sinh khối bổ sung tối ưu nhất. Các mẫu thí nghiệm với các tỷ lệ sinh khối khác nhau được thực hiện trong cùng một điều kiện như nhau là: Nồng độ đường tổng ban đầu 200g/l; Nhiệt độ 300C, pH 6,0; Thời gian 30 giờ. Kết thúc quá trình xử lý, dịch đường được thu hồi và làm sạch. Hàm lượng đường trong dịch sau đó được đem phân tích, kết quả được trình bày trên bảng 9.
Các số liệu trên bảng 9 cho thấy, mẫu xử lý với tỷ lệ sinh khối 25 g/l cho hiệu suất đồng hoá glucoza trong dịch đạt giá trị cao nhất là 56,92 g/l. Với cách xử lý như vậy, hàm lượng đường FOS trong dịch đường tăng từ 50% lên 69,89%.
IV. Kết luận:
Từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm, nhóm nghiên cứu đã tuyển chọn được chủng nấm men HB1.3.13 đặc hiệu có khả năng đồng hoá được glucoza trong dịch đường FOS phổ thông. Thông qua việc xác định điều kiện nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm men và dùng chúng để xử lý tinh chế dịch đường FOS phổ thông, chúng tôi đã làm tăng độ tinh khiết của FOS từ 50% lên xấp xỉ 70%.
TàI liệu tham khảo:
1. Bornet, F.R.J (1994) Undigestible sugars in food products. Am. J. Clin Nutr. 59 (suppl), 763S- 769S.
2. Oku, T., Tokunaga, T. and Hosaya, N. (1984) Nondigestibilty of a new sweetener “Neosugar” in the rat. J. Nutr. 114, 1574-1581.
3. Yamashita, K., Kawai, K. and Itakura, M. (1984) Effects of fructooligosaccharides on blood glucose and serum lipids in diabetic subjects Nutr. Res. 4, 961- 966.
4. Hidaka, H., Hirayama, M. and Sumi, N. (1988) A fructooligosaccharides- producing enzyme b-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611 Agric. Biol. Chem. 52, 1181-1187.
5. Trịnh Thị Kim Vân, (2003) Nghiên cứu sinh tổng hợp, thu nhận và ứng dụng fructosyltransferaza trong sản xuất fructooligosacarit. Luận án tiến sỹ. Q
