Mô hình ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên sự tốc độ tăng trưởng của Aspergillus flavus trên môi trường gạo

TÓM TẮT:

Trong nghiên cứu này, bề mặt đáp ứng của phần mềm Mode 5.0 được sử dụng để mô hình hóa tốc độ tăng trưởng của Aspergillus flavus (A. flavus) với mức ý nghĩa 5% ở nhiệt độ (28, 30, 32^oC) và hoạt độ nước (0.95, 0.97, 0.99 aw). Kết quả nghiên cứu cho thấy, A. flavus phát triển mạnh nhất ở 30^oC, 0.99aw (10.548±0.041 mm.ngày^-1) với phương trình hồi quy y = 3.0459+ 4.10913X₂ + 3.01175X₂². Kết quả nghiên cứu này có thể áp dụng để dự đoán tốc độ tăng trưởng của A. flavus trong quá trình bảo quản gạo.

Từ khóa: Nhiệt độ, hoạt độ nước, Aspergillus flavus, môi trường gạo, tốc độ tăng trưởng, mô hình.

1. Giới thiệu

flavus nhiễm trên gạo sinh ra độc tố thứ cấp Aflatoxins (Reddy, et al. 2009); (Wu, et al. 2009). Trong đó, Aflatoxin B1 được xem là độc tố rất độc, độc tố này được sản sinh ra bởi A. flavus khi chúng phát triển trên các hạt ngủ cốc (Anthony, et al. 2012; Massey, et al. 1995; Schmidt-Heydt, et al. 2009a). Aflatoxin B1 (AFB1) là chất gây ung thư gan (Hsieh and Atkinson 1991; Nixon, et al. 1981), gây suy giảm miễn dịch ở người và động vật (Gauthier 2013).

Sự sinh trưởng, phát triển và sinh độc tố của A. flavus trong các loại thực phẩm bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau như độ ẩm, nhiệt độ, pH, tinh dầu… Đặc biệt là nhiệt độ, hoạt độ nước là 2 yếu tố quan trọng (Holmquist, et al. 1983) (Schmidt-Heydt, et al. 2009b). A. flavus phát triển mạnh ở khoảng nhiệt độ 25 - 42^oC (Guynot, et al. 2005; Mercier and Smilanick 2005; Shahi, et al. 2003), độ ẩm cao sẽ phát triển và sinh độc tố aflatoxins mạnh (Craufurd, et al. 2006; Kebede, et al. 2012). Nhiệt độ và hoạt độ nước đã được nghiên cứu để ứng dụng trong bảo quả lúa gạo (Lahouar, et al. 2016; Mousa, et al. 2016).

Ngoài ra, một số mô hình khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên sự sinh trưởng và sinh độc tố của A. flavus cũng được nghiêm cứu (Baranyi, et al. 1999; Gibson, et al. 1994; Mousa, et al. 2011; Sautour, et al. 2001). Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu nào xây dựng mô hình khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ kết hợp với hoạt độ nước trên môi trường gạo lên sự tăng trưởng của A. flavus. Vì vậy, trong nghiên cứu này tiến hành mô hình hóa ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên sự tăng trưởng của A. flavus trên môi trường gạo.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Chủng nấm mốc và chuẩn bị dịch huyền phù

1. flavus được phân lập từ lúa và được xác định khả năng sinh độc tố AFB1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC MS/MS. Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường Potatose dextrose agar (PDA, Himedia, Ấn Độ) và được bảo quản ở nhiệt độ 4°C tại phòng thí nghiệm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh. A. flavus được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C trong 7 ngày. Bào tử nấm được thu và pha loãng trong PBS (Mỹ, độ tinh khiết 98%) và xác định số bào tử bằng buồng đếm hồng cầu và nồng độ cuối cùng là 10⁶ bào tử/ml.

2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên sự tăng trưởng của A. flavus trên môi trường gạo

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (28, 33, 36, 40^oC) và hoạt độ nước (0.89, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99) lên sự tăng trưởng và phát triển của nấm mốc trong 7 ngày nuôi cấy trên môi trường gạo (bột gạo 2%, agar 2%) (w/v). Glycerol (Xilong, Trung Quốc) được bổ sung vào nước để điều chỉnh môi trường về các hoạt độ nước từ 0.85 đến 0.99 (w/v). 10µl dung dịch bào tử ở nồng độ 10⁶ bào tử/ml được nhỏ vào giữa đĩa petri (đường kính 80 mm) (Dinlab, Đức) chứa 15 ml môi trường đã được hấp tiệt trùng ở 121°C/15 phút. Tiến hành đo đường kính phát triển của khuẩn lạc sau mỗi 24 giờ trong 7 ngày và tính tốc độ tăng trưởng theo công thức sau.

• Tốc độ tăng trưởng trung bình (mm.ngày^-1) của nấm mốc được tính toán theo công thức:

Với: A là tốc độ tăng trưởng trung bình của nấm (mm.ngày^-1); d là đường kính khuẩn lạc (mm); n là số ngày nuôi cấy (n=1,2,3,…).

2.3 .Thiết kế thí nghiệm và mô hình hóa ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên sự tăng trưởng của A. flavus

Tiến hành mô hình hóa 2 yếu tố: nhiệt độ (28, 30, 32^oC) và hoạt độ nước (0.95, 0.97, 0.99 aw) để tìm ra khoảng biến thiên của các thông số hoạt độ nước, nhiệt độ bằng phương pháp thực nghiệm 2 yếu tố. Bề mặt đáp ứng (RSM) được sử dụng để xây dựng mô hình dự đoán ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, hoạt độ nước lên tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus. Khoảng biến thiên của các biến được xác định dựa trên kết quả khảo sát trước đó. Hàm mục tiêu đại diện cho dự đoán tốc độ tăng trưởng của A. flavus. Mối quan hệ giữa các biến và hàm mục tiêu là phương trình hồi quy đa biến có dạng tổng quát như sau: (Y) = A₀+A₁X₁+A₂X₂+A₁₂X₁X₂+A₁₁X₁²+A₂₂X₂²

Các hệ số của phương trình hồi quy thực nghiệm được ước lượng bằng phương pháp bình phương cực tiểu; tính tương thích chung của mô hình được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA; α = 0,05); ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra bằng kiểm định Student (α = 0,05). Điều kiện tối ưu được dự đoán và xác minh lại bằng thực nghiệm. 

3. Kết quả và bàn luận

3.1. Ảnh hưởng của hoạt độ nước lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus ở nhiệt độ 30

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ nước lên sự tăng trưởng của nấm mốc ở nhiệt độ 30^oC được trình bày ở Hình 1. Dữ liệu nghiên cứu cho thấy, hoạt độ nước có ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus ở 30 trên môi trường gạo (p<0,05) trong 7 ngày nuôi cấy.  Ở hoạt độ nước 0.99 aw, tốc độ tăng trưởng mạnh nhất (10.548±0.041 mm.ngày^-1) sau đó giảm dần khi hoạt độ nước giảm. Ở hoạt độ nước 0.91aw, A. flavus bắt đầu tăng trưởng vào ngày thứ 4 và sau 7 ngày nuôi cấy, tốc độ tăng trưởng là 0.881±0.09 mm.ngày^-1. Ở hoạt độ nước 0.89 aw, A. flavus bị ức chế hoàn toàn (Hình 1).

3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nhiệt độ lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus  ở hoạt độ nước 0.99aw trên môi trường gạo

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (28^oC, 30^oC, 33^oC, 36^oC và 40^oC) lên sự tăng trưởng của A. flavus  ở hoạt độ nước 0.99aw trên môi trường gạo được biểu thị ở Hình 2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ cũng ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus (p<0.05).

Hoạt độ nước 0.99 aw, A. flavus tăng trưởng mạnh nhất ở 30^oC với tốc độ tăng trưởng sau 7 này là 10.548±0.041 mm.ngày^-1, giảm dần ở 33^oC (10.024±0.165 mm.ngày^-1), 28^oC  (9.167±0.218 mm.ngày^-1), 36^oC (6.583±0.074 mm.ngày^-1) và thấp nhất ở 40^oC (3.857±0.071 mm.ngày^-1) (Hình 2).

3.3. Mô hình hóa ảnh hưởng của nhiệt độ và hoạt độ nước lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus

Điểm tâm của nhiệt độ là 30^oC. Đây là nhiệt độ A. flavus phát triển mạnh nhất với tốc độ tăng trưởng 10.548±0.041 mm.ngày^-1, tốc độ tăng trưởng ở 28⁰C và 32^oC là 9.167±0.218 mm.ngày^-1 và 10.024±0.165 mm.ngày^-1với mức ý nghĩa 5% được kiểm chứng bởi Microsoft Excel 2010, nên bước nhảy được chọn là 2 (28^oC, 32^oC). Tương tự như nhiệt độ, hoạt độ nước được chọn với bước nhảy 0.02 và tâm là 0.97. Bề mặt đáp ứng (RSM) được áp dụng để tối ưu hóa các điều kiện ức chế tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus. Bên cạnh đó, quy hoạch thực nghiệm gồm 11 thí nghiệm với 8 thí nghiệm ở nhân phương án và 3 thí nghiệm ở tâm. Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày ở Bảng 1.

Xét một cách tổng quát, mô hình hồi quy tương thích với thực nghiệm, với giá trị R²= 0.972 thì phương trình có thể giải thích được 97.2% những giá trị mà phương trình đưa ra.

Mức độ tác động, ảnh hưởng của các yếu tố (biến khảo sát) lên tốc độ tăng trưởng trung bình (hàm mục tiêu) thông qua hệ số giá trị ước lượng và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê thể hiện thông qua trị số P. Nếu hệ số giá trị ước lượng của một biến mang giá trị dương nghĩa là khi giá trị biến đó tăng sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Nếu hệ số giá trị ước lượng của một biến mang giá trị âm thì khi giá trị biến đó tăng sẽ làm giá trị hàm mục tiêu giảm. Tốc độ tăng trưởng trung bình = 3.0459+ 4.10913X₂ + 3.01175X₂² (trong đó, X₂ lần lượt là nhiệt độ, hoạt độ nước). Kết quả thực nghiệm cũng cho thấy, mức độ ảnh hưởng của các yếu tố lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus. Với mức ý nghĩa 5%, cùng với giá trị thực hiện thí nghiệm của nhiệt độ ở 28^oC đến 32^oC thì giá trị nhiệt độ và bình phương nhiệt độ không có nghĩa về mặt thống kê, tạm xem như là không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus (p>0.05). Hoạt độ nước và bình phương hoạt độ nước tác động dương và tác động mạnh đến tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus (p<0.05). (Hình 3)

Trong nghiên cứu này, yếu tố nhiệt độ và hoạt độ nước đều ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng và phát triển của A. flavus. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với các nghiên cứu trước đây. Theo Antonia Gallo (2015), nhiệt độ và hoạt độ nước là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng của A. flavus, tác giả này cũng cho rằng A. flavus tăng trưởng ở  hoạt độ nước 0.96-0.99 aw ở nhiệt độ 28°C (Gibson, et al. 1994; Pitt and Hocking 2009). Theo Pratiwi và cộng sự (2015), S. Samapundo và cộng sự (2007) A. flavus phát triển tốt nhất ở 30^oC. Kết quả thực nghiệm của chúng cho thấy tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus tương tự như một đồ thị hình sin mà điểm cực đại của nó đạt được là ở 30^oC (10.548±0.041 mm.ngày^-1). Ngoài ra, qua nghiên cứu này, đã đưa ra dự đoán về tốc độ tăng trưởng trung bình của A. flavus khi biết được 2 yếu tố nhiệt độ, hoạt độ nước.  

4. Kết luận

Nhiệt độ và hoạt độ nước đều ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng và phát triển của A. flavus (p<0.05). A. flavus phát triển mạnh nhất ở 30^oC, 0.99aw (10.548±0.041 mm.ngày^-1) với phương trình hồi quy y = 3.0459+ 4.10913X₂ + 3.01175X₂². Kết quả nghiên cứu này có thể áp dụng để dự đoán tốc độ tăng trưởng của A. flavus trong quá trình bảo quản gạo.

Lời cảm ơn: Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP. HCM đã hỗ trợ toàn bộ kinh phí cũng như các dụng cụ, thiết bị để nhóm hoàn thành đề tài nghiên cứu tốt nhất có thể.

 TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Anthony, Makun Hussaini, et al.2012. Aflatoxin contamination in foods and feeds: A special focus on Africa. Trends Vital Food Control Eng.
2. Baranyi, Jozsef, Carmen Pin, and Thomas Ross 1999. Validating and comparing predictive models. International journal of food microbiology 48(3):159-166.
3. Craufurd, PQ, et al.2006 Drought, pod yield, pre-harvest Aspergillus infection and aflatoxin contamination on peanut in Niger. 98(1):20-29.
4. Gauthier, Gregory M.2013 Crossover fungal pathogens: The biology and pathogenesis of fungi.
5. Gibson, Angela M, et al.1994 Predicting fungal growth: The effect of water activity on Aspergillus flavus and related species. International journal of food microbiology 23(3-4):419-431.
6. Guynot, ME, et al.2005 Screening for antifungal activity of some essential oils against common spoilage fungi of bakery products. 11(1):25-32.
7. Holmquist, GU, HW Walker, and HM %J Journal of Food Science Stahr.1983 Influence of temperature, pH, water activity and antifungal agents on growth of Aspergillus flavus and A. parasiticus. 48(3): 778-782.
8. Hsieh, Dennis PH, and David N Atkinson.1991 Bisfuranoid mycotoxins: their genotoxicity and carcinogenicity. In Biological reactive intermediates IV. Pp. 525-532: Springer.
9. Kebede, Hirut, et al.2012 Relationship between aflatoxin contamination and physiological responses of corn plants under drought and heat stress. 4 (11): 1385-1403.
10. Lahouar, Amani, et al.2016 Effects of temperature, water activity and incubation time on fungal growth and aflatoxin B1 production by toxinogenic Aspergillus flavus isolates on sorghum seeds. Revista Argentina de microbiologia 48(1):78-85.
11. Massey, Thomas E, et al.1995 Biochemical and molecular aspects of mammalian susceptibility to aflatoxin B1 carcinogenicity. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 208(3): 213-227.
12. Mercier, Julien, and JL %J Biological Control Smilanick. 2005 Control of green mold and sour rot of stored lemon by biofumigation with Muscodor albus. 32(3):401-407.
13. Mousa, W, et al.2011 Modelling the effect of water activity and temperature on growth rate and aflatoxin production by two isolates of Aspergillus flavus on paddy. Journal of applied microbiology 111(5):1262-1274.
14. Mousa, Wael, et al.2016 Temperature, water activity and gas composition effects on the growth and aflatoxin production by Aspergillus flavus on paddy. Journal of Stored Products Research 67:49-55.
15. Nixon, JE, et al.1981 Carcinogenicity of Aflatoxlcol in Fischer 344 Rats. JNCI: Journal of the National Cancer Institute 66(6):1159-1163.
16. Pitt, John I, and Ailsa D Hocking.2009 The ecology of fungal food spoilage. In Fungi and food spoilage. Pp. 3-9: Springer.
17. Reddy, KRN, et al.2009 Aflatoxin B 1 producing potential of Aspergillus flavus strains isolated from stored rice grains. African Journal of Biotechnology 8(14).
18. Sautour, Marc, et al.2001 A temperature-type model for describing the relationship between fungal growth and water activity. International Journal of Food Microbiology 67(1-2):63-69.
19. Schmidt-Heydt, Markus, et al.2009a Complex regulation of the aflatoxin biosynthesis gene cluster of Aspergillus flavus in relation to various combinations of water activity and temperature. International journal of food microbiology 135(3):231-237.
20. Schmidt-Heydt, Markus, et al.2009b Complex regulation of the aflatoxin biosynthesis gene cluster of Aspergillus flavus in relation to various combinations of water activity and temperature. 135(3):231-237.
21. Shahi, Sushil K, et al.2003 Use of essential oil as botanical-pesticide against post harvest spoilage in Malus pumilo fruit. 48(2):223-232.
22. Wu, Qinghua, et al.2009 Biological degradation of aflatoxins. Drug Metabolism Reviews 41(1):1-7.

MODELLING EEFECTS OF TEMPERATURE AND WATER ACTIVITY ON Aspergillus Flavus  GROWTH RATE ON RICE MEDIUM

Master. PHAN THI KIM LIEN - NGUYEN NHAT HUY

Master. ĐINH THI HAI THUAN

 Faculty of Food technology, Ho Chi Minh City University of Food industry

ABSTRACT:

In this study, Response Surface Methodology - RSM of Mode 5.0 was used to modelling influence of temperature (28, 30, 32^oC) and water activity (0.95, 0.97, 0.99 aw) on Aspergillus flavus (A. flavus) growth rate with 5% confidence. The results showed that A. flavus grew maximum at 30^oC, 0.99aw (10.548±0.041 mm.ngày-1) with the regression equation y = 3.0459+ 4.10913X2 + 3.01175X22. The results can be applied to predict A. flavus growth rate on rice during storage

Keywords: Temperature, water activity, Aspergillus flavus, rice medium, growth rate, modeling.