Sâm Triều Tiên, tức nhân sâm có tên khoa học là Panax ginseng C.A Mey. Sở dĩ gọi là nhân sâm (ginseng) là do củ giống hình người. Tác dụng dược lý của Sâm đã được nhiều nhà khoa học ở Việt Nam cũng như trên thế giới nghiên cứu chứng minh, như tăng lực, tăng trí nhớ, bảo vệ cơ thể chống stress, tác động lên hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, giúp chống viêm, ngăn cản sự lão hóa,…
Tại Hàn Quốc và một số nước khác, sâm đã được nuôi cấy tạo rễ bất định thành công và được ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp, tạo được sinh khối rất lớn, đáp ứng nhu cầu của xã hội, rút ngắn thời gian sản xuất đáng kể, cho hiệu quả kinh tế to lớn.
Tại Việt Nam, cho đến nay chưa sản xuất được sâm Triều Tiên, hầu hết phải nhập từ củ và các sản phẩm từ củ đã qua chế biến.
Việc nghiên cứu tạo rễ bất định và nhân sinh khối sâm Triều Tiên thành công sẽ mở ra một hướng mới cho ngành dược liệu nước nhà.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
1. Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu là những củ sâm Triều tiên 6 tuổi nhập từ Hàn quốc.
Sử dụng các môi trường: MS (Murashige and Skoog, 1962), 3/4MS và 1/2MS được bổ sung các chất: 2,4 D (2,4 Diclophenoxyl acetic acid); IBA (Indol-3 Butyric Acid), và NAA (α-naphthalene acetic acid) để theo dõi sự hình thành mô sẹo và rễ bất định.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Xử lý mẫu thực nghiệm:
- Những củ sâm Triều Tiên tươi, sau khi nhập về, được rửa sạch và tiến hành khử trùng bằng Javen ở các nồng độ khác nhau.
- Mẫu sau khi khử trùng, được cắt thành từng khối có kích thước 1cm x 1cm x 0,25cm, sau đó cấy vào các bình thuỷ tinh 100ml có chứa sẵn 20ml dung môi đặt trong tối hoàn toàn. Tất cả mọi thao tác được tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
2.2. Phương pháp thực nghiệm:
- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng của các môi trường MS, 3/4MS 1/2MS lên sự hình thành rễ bất định: Dung môi sử dụng trong các thí nghiệm là dung môi MS (Murashige và Skoog, 1962): MS, 3/4MS, 1/2MS. Dung môi và các dụng cụ nuôi cấy được vô trùng trong Autoclave ở 1210C, 1atm trong 30 phút.
- Khảo sát tác động của 2,4 D lên sự hình thành sẹo và rễ bất định của mẫu cấy: Bổ sung 2,4 D vào dung môi MS, 3/4MS, 1/2MS với tỷ lệ: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mg/L.
- Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định in-vitro: Bổ sung IBA vào dung môi MS, 3/4MS, 1/2MS với tỷ lệ: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/L.
- Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định in-vitro: Bổ sung IBA vào dung môi MS, 3/4MS, 1/2MS với tỷ lệ: 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/L.
- Mỗi nghiệm thức sử dụng 10 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu.
2.3. Xử lý số liệu:
- Số liệu được đo đếm sau 30 và 60 ngày nuôi cấy trên tất cả 10 bình cho mỗi nghiệm thức.
- Số liệu thu được, được xử lý thống kê bằng phần mềm MSTAT-C.
Kết quả và thảo luận
Mặc dù có hàng trăm môi trường nuôi cấy dùng để nuôi cấy các loài thực vật khác nhau, nhưng môi trường MS được sử dụng nhiều nhất, thường chỉ thay đổi các thành phần khoáng đa lượng .
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm tạo sẹo sâm Triều Tiên trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau và tạo sinh khối rễ bất định trên các nồng độ khoáng của môi trường MS, có bổ sung các chất tạo rễ thuộc nhóm Auxin (IBA, NAA).
1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 D lên sự hình thành sẹo và rễ bất định của mẫu cấy củ tự nhiên.
Sau 7 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy trên môi trường có nồng độ 2,4-D cao hơn 0.5mg/L bắt đầu có sự hình thành sẹo (callus). Các mẫu nuôi cấy trên môi trường 3mg/L 2,4-D hình thành sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, còn các mẫu nuôi cấy trên môi trường không có 2,4-D lại không có sự hình thành sẹo. Điều đó chứng tỏ sự có mặt của 2,4-D là cần thiết cho sự hình thành mô sẹo. Các mô sẹo hình thành trên môi trường có bổ sung 3mg/L 2,4-D sinh trưởng mạnh, khối sẹo lớn lên rất nhanh, có màu trắng, mềm, xốp, sau 2 tháng nuôi cấy có sự xuất hiện rễ bất định. Trong khi đó, các mẫu nuôi cấy trên các môi trường có nồng độ 2,4-D cao hơn 3mg/L thì sự sinh trưởng của khối sẹo càng giảm, không xuất hiện rễ bất định và sẹo già đi nhanh chóng, đặt biệt các mẫu nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 5mg/L 2,4-D chỉ sau 25 ngày nuôi cấy đã chuyển sang màu vàng; các khối sẹo cũng cứng, ít xốp hơn. Các mô sẹo hình thành trên môi trường 0,5-2,5mg/L 2,4-D giai đoạn từ 40 – 60 ngày sau nuôi cấy, tăng kích thước rất chậm và cũng không xuất hiện rễ bất định.
Như vậy, nồng độ 2,4-D không chỉ có tác dụng gây phản biệt hóa các tế bào trong mẫu cấy, tạo khối mô sẹo, sẵn sàng cho sự tái biệt hóa phát sinh hình thái về sau mà nó còn có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sự sinh trưởng của khối mô sẹo. Điều đó có thể được giải thích là do sự hiện diện của 2,4-D trong môi trường làm tăng hàm lượng các DNA, RNA, đặc biệt là mRNA trong mẫu cấy, do đó làm gia tăng quá trình tổng hợp các protein, dẫn đến sự gia tăng sinh khối của mẫu cấy. Nồng độ 2,4-D tăng làm tăng quá trình tổng hợp protein, nhưng khi hàm lượng 2,4-D quá cao, nó sẽ làm gia tăng các RNA, và dạng tích lũy là rRNA (Thomas C. Moore, 1989), do đó mẫu cấy trở nên sinh trưởng chậm hẳn đi, khối mô sẹo trở nên chai cứng và nhanh già.
Nồng độ 2,4-D trong môi trường nuôi cấy thấp sẽ làm thời gian cảm ứng tạo sẹo kéo dài, khối mô sẹo tăng trưởng chậm. Khi nồng độ 2,4-D vượt quá mức 3mg/L giúp rút ngắn thời gian cảm ứng tạo sẹo của mẫu cấy, nhưng gây ức chế quá trình sinh trưởng của khối mô sẹo, tạo khối mô sẹo cứng, nhanh già.
Qua đó có thể tạm thời kết luận: Môi trường thích hợp cho sự hình thành sẹo và rễ bất định ở mẫu cấy củ sâm Triều Tiên là môi trường MS có bổ sung 3mg/L 2,4-D, 30g/l Succro, 8g/l agar. (xem hinh 1)
2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định in-vitro của sâm Triều Tiên trên các môi trường MS, 3/4MS và 1/2MS. (bảng 1)
Đối với sâm Triều Tiên, thời gian cảm ứng và tạo sẹo của các mô rễ nuôi cấy trên các môi trường tương đối nhanh, chỉ khoảng 5 – 7 ngày kể từ khi nuôi cấy. 100% số mẫu nuôi cấy trên các môi trường thí nghiệm có bổ sung IBA đều có sự đáp ứng tạo sẹo, tuy nhiên sau 1 tháng nuôi cấy, số lượng rễ hình thành/mẫu cấy ở các nồng độ IBA bổ sung khác nhau thì khác nhau, hiệu quả cao nhất là trên môi trường 1/2MS có bổ sung 3 mg/L IBA. Số lượng rễ hình thành/mẫu đạt 16.5 rễ/mẫu cấy (Bảng 1). Trên tất cả các thí nghiệm không có bổ sung IBA thì không thấy hình thành sẹo và rễ bất định, điều này cho thấy, Auxin nội sinh có trong mẫu không đủ để cảm ứng cho việc hình thành sẹo và rễ bất định trên đối tượng này. (xem hinh 2)
Vậy IBA có hiệu quả kích thích sự hình thành rễ bất định in-vitro trên đối tượng sâm Triều tiên ở nồng độ không quá cao (3mg/L).
3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Triều Tiên trên các môi trường MS , 3/4MS , 1/2MS. (bảng 2)
Những mẫu rễ cấy trên môi trường 1/2MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau đều cho kết quả cao hơn so với trên các môi trường khác (MS, 3/4MS) có cùng nồng độ NAA tương ứng, kết quả đạt cao nhất khi mẫu rễ được nuôi cấy trên môi trường 1/2MS có bổ sung NAA ở nồng độ 2mg/L, đạt 17,2 rễ/mẫu cấy, tuy nhiên trên môi trường 3/4MS có bổ sung NAA cùng nồng độ (2mg/L), cũng cho kết quả khả quan đạt 16,6 rễ/mẫu cấy.
Chúng tôi cũng đã tiến hành thí nghiệm kiểm chứng so sánh lại giữa môi trường 1/2MS và môi trường 3/4MS có bổ sung NAA ở các nồng độ 1, 2, 3, 4 mg/L để xác định chính xác hơn môi trường nào và nồng độ nào của NAA cho hiệu quả tăng sinh khối cao nhất. Kết quả cũng nhận thấy môi trường phù hợp nhất vẫn là môi trường 1/2MS và nồng độ NAA thích hợp nhất vẫn là 2mg/L. Nồng độ NAA càng thấp (dưới 2mg/L) số lượng rễ bất định hình thành càng ít, và khi nồng độ NAA trong môi trường tăng lên trên 2 mg/L số lượng rễ hình thành lại có xu hướng giảm đi. Đó là do nồng độ cao của auxin sẽ khiến nó trở thành tác nhân ức chế sự hình thành rễ ở mẫu cấy.
So sánh giữa các môi trường nuôi cấy có IBA và NAA, chúng tôi nhận thấy các môi trường có bổ sung IBA đều cho kết quả (số lượng rễ hình thành) kém hơn so với các môi trường tương ứng có bổ sung NAA ở cùng nồng độ, chứng tỏ NAA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ bất định ở sâm Triều Tiên. (xem hinh 3.4.5,6)
Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu thu được có thể rút ra các kết luận sau:
1. Môi trường MS có bổ sung 2,4-D (nồng độ 3mg/L) thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ nguồn mẫu cấy tự nhiên.
2. Rễ bất định sâm Triều Tiên hình thành và có khả năng phát triển tốt trên môi trường 1/2MS.
3. Các môi trường có bổ sung IBA đều cho kết quả (số lượng rễ hình thành) kém hơn so với các môi trường tương ứng có bổ sung NAA ở cùng nồng độ, chứng tỏ NAA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ bất định ở sâm Triều Tiên. Như vậy, auxin kích thích ra rễ ở sâm Triều Tiên hiệu quả nhất là NAA, được sử dụng ở nồng độ 2mg/L.
