Hiệu quả phương pháp khử trùng và loại vật liệu ban đầu trong nghiên cứu nhân giống in-vitro Hippeastrum esquestre Herb

TÓM TẮT:

Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu ex vitro của cây hoa Mạc Chu Lan đỏ nhung được khử trùng bằng HgCl₂ và Javen với nồng độ và thời gian xử lý khác nhau, Kết quả thí nghiệm cho thấy, mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng được khử trùng bằng HgCl₂ (0,1 %) trong thời gian 12 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất. Môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar và 1,5 mg/l kinetin cho hiệu quả tái sinh chồi cao hơn so với nghiệm thức khác.

Từ khóa: khử trùng, nhân giống in-vitro, tạo chồi, HgCl_2, Javen.

1. Đặt vấn đề

Mạc Chu Lan (Hippeastrum equestre Herb), còn gọi là hoa Loa kèn đỏ nhung, Tứ diện xích lan…, có 30 chi và trên 100 loài [1]. Hippeastrum có nguồn gốc từ Hà Lan và Nam Phi, nhưng đã phổ biến rộng tại Hoa Kỳ, Nhật Bản, Israel và Australia bởi giá trị về thẩm mỹ để trang trí nội thất hoặc làm quà tặng [3]. Việc nhân giống Hippeastrum có thể từ củ con, lát cắt thân hành hoặc bằng hạt nhưng mất nhiều thời gian, cây không đồng nhất, dễ nhiễm sâu bệnh nên việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô được mở rộng [6]. Nhân giống nuôi cấy mô bao gồm nhiều giai đoạn, như: lựa chọn nguồn mẫu, thiết lập nguồn mẫu vô trùng, nhân giống, ra rễ và thích nghi của cây con [2]. Trong đó, khử trùng mẫu để thiết lập mẫu vô trùng là bước quan trọng và quyết định đến sự thành công của cả quy trình nhân giống. Khử trùng mẫu giúp mẫu được khử nhiễm trong chất khử trùng mà không làm chết tế bào [4]. Các nghiên cứu nuôi cấy mô trên thế giới liên quan đến chi Hippeastrum đã được báo cáo từ những năm 1974, tuy nhiên những nghiên cứu ở Việt Nam còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu về phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và xác định vật liệu nuôi cấy ban đầu phục vụ nhân nhanh giống in vitro hoa Mạc Chu Lan đỏ nhung là rất cần thiết.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Phương pháp khử trùng mẫu

Củ giống sau khi thu về được rửa sạch dưới vòi nước chảy nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong xà phòng 10 phút rồi rửa sạch bằng nước cất. Mẫu được đưa vào buồng cấy vô trùng, tiếp tục rửa qua 1 lần bằng nước cất rồi ngâm mẫu trong cồn 70^oC trong 30 giây, tráng lại bằng nước cất vô trùng 1-2 lần. Tiến hành thí nghiệm khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl₂ 0,1% trong các khoảng thời gian 5; 7; 10; 12; 15 và 20 phút. Đối với Javen, khử trùng với tỷ lệ 30% và 50% trong thời gian thay đổi 5; 10; 15; 20 phút. Mẫu sau đó được rửa lại 4-5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó, cắt mẫu với kích thước khác nhau tùy vào từng thí nghiệm và cấy vào môi trường nuôi cấy.

2.2. Phương pháp tái sinh chồi

Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS bổ sung 30 g/l saccarose, 7 g/l agar và chất điều tiết sinh trưởng kinetin (với các nồng độ thay đổi 0,0; 1,0 ;1,5 ;2,0; 2,5 và 3,0 mg/l), pH của môi trường được chỉnh về 5,8-6 rồi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121^oC và áp suất 1,1 atm trong 20 phút. Mẫu cấy được đặt trong buồng nuôi có nhiệt độ 25^oC ± 2, cường độ ánh sáng 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi bình cấy 3 mẫu. Các số liệu được phân tích thống kê bằng chương trình MS Excel và phần mềm MSTATC, so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp kiểm định Ducan và LSD ở mức ý nghĩa 5%, kiểm tra độ biến động của thí nghiệm CV%.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy

3.1.1. Ảnh hưởng chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu

Để xác định hiệu quả của chất khử trùng đến mẫu ban đầu, nghiên cứu sử dụng 2 dung dịch rất phổ biến trong khử trùng mẫu nuôi cấy mô là HgCl₂ 0,1% và Javen với các nồng độ khác nhau, đây là các hóa chất có tác dụng khử trùng mạnh, hiệu quả và đã được sử dụng phổ biến trong nhân giống in vitro.

Bảng 1. Ảnh hưởng của HgCl2 0.1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu đế củ mang 2 vảy củ và đế củ mang đỉnh sinh trưởng

Thời gian khử trùng (phút)	Mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng			Mẫu đế củ mang 2 vảy củ			Mẫu rễ
	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)
05	78,90a	16,67d	04,43e	80,00a	13,33e	06,67e	91,10a	02,23e	06,67e
07	66,67b	21,10d	12,23d	68,89b	22,22d	08,89de	76,67b	10,00d	13.33d
10	31,10c	45,56b	23,34c	54,43c	32,23bc	13,34cd	63,33c	15,57c	21,10c
12	15,57d	58,90a	25,53c	41,10d	40,00b	18,90c	55,57c	17,77bc	26,66c
15	14,4d	40,00b	45,57b	21,10e	51,10a	27,80b	28,90d	25,57a	45,53b
20	10,00d	28,90c	61,10a	17,77e	25,57cd	56,66a	20,00e	21,10b	58,90a
CV%	8,70	11,16	10,24	8,35	14,9	16,34	8,07%	14,46	12,38
LSD5%	1,68	2,10	1,57	2,10	2,45	1,92	2,41	1,19	1,92

Chú thích: Các giá trị trong cùng một cột chỉ cần có 1 mẫu tự giống nhau sẽ không khác nhau về ý nghĩa thống kê (P>0,05)

                                                             Nguồn: Nhóm tác giả thực hiện

Đối với HgCl₂, mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng có hiệu quả khử trùng tốt nhất cả về thời gian (12 phút) và tỷ lệ mẫu sống (58,90%) so với 2 loại mẫu còn lại (Bảng1). Đối với mẫu đế củ mang 2 vảy củ và mẫu rễ, tỷ lệ mẫu sống tăng khi tăng thời gian khử trùng từ 5 đến 15 phút và hiệu quả khử trùng cao nhất ở mức thời gian 15 phút (với mẫu rễ là 25,57% và mẫu đế củ mang 2 vảy củ là 51,10%). Khi tăng thời gian khử trùng lên 20 phút thì ở cả 3 loại mẫu tỷ lệ mẫu sống giảm rõ rệt. Chi Hippeastrum có thân hành, sống lâu năm, dưới đế có một hệ rễ chùm làm cho củ hoa thường chứa nhiều vi khuẩn và nấm mốc gây khó khăn trong quá trình khử trùng mẫu. Vì vậy, thời gian khử trùng 5 phút sẽ tương đối hiệu quả với các đối tượng cây trồng khác, nhưng với cây hoa Mạc Chu Lan, tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh vẫn rất cao, sự hoại tử và chuyển sang màu nâu được quan sát thấy 2/3 mẫu cấy [5].

Bảng 2. Ảnh hưởng của dung dịch Javen ở các nồng độ và thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu rễ, đế củ mang 2 vảy củ và đế củ mang đỉnh sinh trưởng

Thời gian khử trùng (phút	Tỷ lệ %	Mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng			Mẫu đế củ mang 2 vảy củ			Mẫu rễ
		Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sống (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)
05	30%	87,77a	10,00e	02,23e	92,23a	07,77e	00,00f	100,0a	00,0d	00,00f
10		56,67b	25,57d	17,76cd	60,00b	20,00d	20,00de	81,10b	07,77c	11,13e
15		43,33d	34,43c	22,24c	43,33cd	32,23 c	24,44 c	66,67cd	13,33b	20,00d
20		31,10e	40,00bc	28,90b	33,33e	35,57bc	31,10b	51,10e	18,90a	30,00c
05	50%	50,00c	35,57c	14,43d	52,23c	31,10c	16,67e	74,43bc	12,23b	13,34e
10		36,67e	43,33ab	20,00c	41,10d	40,00ab	18,90de	63,33d	14,33b	22,34d
15		23,33f	48,90a	27,77b	33,33e	45,57a	21,10cd	35,57f	21,10a	43,33b
20		18,90f	26,67d	54,43a	22,23f	21,10d	56,67a	25,57g	12,23b	62,20a
CV %		8,13	10,89	11,60	8,76	12,7	10,39	7,96	18,86	13,19
LSD 5%		1,84	1,87	1,410	2,15	1,94	1,27	2,57	1,22	1,73

Chú thích: Các giá trị trong cùng một cột chỉ cần có 1 mẫu tự giống nhau sẽ không khác nhau về ý nghĩa thống kê (P>0,05

                                                         Nguồn: Nhóm tác giả thực hiện

Kết quả nghiên cứu ở Bảng 2 cho thấy, thử nghiệm khử trùng bằng Javen 30% có tỷ lệ mẫu sống và mẫu nhiễm bệnh đều cao hơn so với các công thức khử trùng bằng Javen 50% đối với cả ba loại mẫu. Ở nồng độ 50%, khi tăng thời gian khử trùng từ 5 đến 15 phút thì tỷ lệ mẫu sống tăng, cao nhất ở thời gian 15 phút, nhưng khi tăng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống giảm. Dựa trên kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng độ chất khử trùng cao trong thời gian dài sẽ làm giảm khả năng sống sót của mẫu, dẫn đến tỷ lệ mẫu chết tăng cao 62,20%.

Như vậy, giữa các công thức thí nghiệm, mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng được khử trùng với HgCl₂ (0,1%) trong thời gian 12 phút cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm có thể chấp nhận được và tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 58,90%. Đây là công thức có hiệu quả tốt nhất trong các công thức thí nghiệm.

3.2. Thử nghiệm tái sinh chồi

Sau 8 tuần theo dõi thí nghiệm kết quả cho thấy kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tái sinh chồi. (Bảng 3)

Bảng 3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi in vitro mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng và mẫu đế củ mang 2 vảy củ

Nồng độ Kinetin (mg/l)	Mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng			Mẫu đế củ mang 2 vảy củ
	Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)	Chiều cao trung bình chồi (cm)	Hệ số nhân (chồi/mẫu)	Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)	Chiều cao trung bình chồi (cm)	Hệ số nhân (chồi/mẫu)
0	32,23c	1,52e	1,27c	27,77c	1,35c	1,20c
1.0	37,77bc	1,96d	1,83b	31,10bc	2,05b	1,68b
1.5	48,90a	2,72b	2,19a	36,57b	2,53a	2,04a
2.0	41,10b	3,18a	2,15a	43,33a	2,45ab	2,14a
2.5	38,90bc	2,37c	2,06a	36,67ab	2,16ab	2,00a
3.0	37,77bc	2,26c	1,75b	36,67ab	2,36ab	1,74b
CV %	10,35	4,68	6,61	11,60	11,48	7,60
LSD 5%	2,18	0,19	0,22	2,18	0,43	0,25

Chú thích: Các giá trị trong cùng một cột chỉ cần có 1 mẫu tự giống nhau sẽ không khác nhau về ý nghĩa thống kê (P>0,05)

                                                         Nguồn: Nhóm tác giả thực hiện

So với công thức đối chứng (0 mg/l kinetin) có tỷ lệ tạo chồi ở cả 2 loại mẫu cấy đều thấp hơn so với công thức có bổ sung kinetin. Ở mẫu đế củ mang đỉnh sinh tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất ở công thức có nồng độ kinetin 1.5 mg/l đạt 48.90%, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5%, nhưng nếu tăng hàm lượng kinetin thì tỷ lệ mẫu tạo chồi giảm dần 41,1-37,77%. Đối với mẫu đế củ mang 2 vảy củ, tỷ lệ tạo chồi cao nhất ở nồng độ kinetin 2 mg/l (43,33%) và khi tăng nồng độ kinetin, tỉ lệ mẫu tạo chồi cũng có xu hướng giảm (36,67%). Nồng độ kinetin từ 1,5 - 2,5 mg/l thì hệ số nhân chồi ở cả 2 mẫu không có sự sai khác về mặt thống kê. Chiều cao chồi ở mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng trong khoảng 2,37-3,18 chồi/mẫu, cao hơn so với mẫu đế củ mang 2 vảy củ 2,16-2,53 chồi/mẫu. Vậy giữa các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi, mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng cho hiệu quả tốt nhất ở nồng độ kinetin 1.5 mg/l với tỷ lệ nhân chồi 2,19 chồi/mẫu và chiều cao chồi đạt 2,72cm.

4. Kết luận

Kết quả của nghiên cứu xác định phương pháp khử trùng mẫu dùng HgCl₂ 0,1% trong 12 phút có tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất 58,90%, trong đó mẫu đế củ có hiệu quả khử trùng tốt hơn so với   mẫu với nguồn ex vitro từ mẫu rễ của cây hoa Mạc Chu Lan đỏ nhung. Mẫu đế củ mang đỉnh sinh trưởng cho hệ số tái sinh chồi tốt nhất trong môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar và 1,5 mg/l kinetin. Trên môi trường này, mẫu phát sinh hình thái đạt 48,90%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Vũ Văn Chuyên, Trần Hợp và Lê Trần Chấn (1986). Địa lý các họ cây Việt Nam. NXB Khoa học Kỹ thuật, Thành phố Hồ Chí Minh.
2. De Bruyn M. and Zimmerman R. H. (1991). Micropropagation: Technology and Application. Germany: Springer.
3. Meerow A. W., Broschat T. K., and Kane M. E. (1991). Hippeastrum breeding at the University of Florida. Herbertia (USA).
4. Mihaljević I, Dugalić K., Tomaš V., et al. (2013). In vitro sterilization procedures for micropropagation of ‘Oblačinska’sour cherry. Journal of Agricultural Sciences, Belgrade, 58(2), 117-126.
5. Seabrook J. E. and Cumming B. G. (1977). The in vitro propagation of Amaryllis (Hippeastrum spp. hybrids). In vitro, 13(12), 831-836.
6. Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Hạnh Hoa và cs. (2009). Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh In vitro Hoa lao kèn đỏ nhung (Hippeastrum equestre Herb). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(4), 453-459.                                                                                                          

The effectiveness of the sterilization process and culture materials in the in-vitro breeding of Hippeastrum equestre Herb

Le Thi Hong Phuong¹

Vo Van Tan²

Duong Cong Vinh³

Nguyen Thi Kim Thoa¹

Vu Thi Anh Ngoc¹

¹Nong Lam University of Ho Chi Minh City - Gia Lai Campus

²Van Canh High School, Van Canh District, Binh Đinh Province

³Building Up Sustainability Centre

ABSTRACT:

In this study, the ex vitro explants of Hippeastrum equestre Herb are sterilized with agents of HgCl₂ and Javen at different concentrations and treatment times. Experimental results show that the root base which is sterilized with 0.1 % HgCl2 for 12 minutes gives the highest rate of living explants. In addition, MS medium supplemented with 30% sucrose, 7 g/l agar and 1.5 mg/l kinetin produces the best bud regeneration.

Keywords: sterilization, in vitro propagation, shoot formation, HgCl₂, Javen.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 25 tháng 11  năm 2022]