Nguyên vật liệu và phương pháp
Hệ thống xử lý nước thải từ sản xuất bia
Nghiên cứu động học hệ sinh thái bùn kỵ khí được thực hiện trên hệ thống xử lý nước thải tại Xưởng Bia thực nghiệm của Viện Công nghiệp thực phẩm. Hệ thống này họat động theo nguyên lý UASB. Các mẫu phẩm được lấy từ đáy của tank kỵ khí trong suốt thời gian từ khi hệ thống bắt đầu khởi động cho tới lúc hoạt động ổn định. Mẫu được bảo quản trong ống Falcon ở -20oC và phân tích đồng thời tại thời điểm cuối của quá trình.
Tách chiết ADN
Tế bào vi sinh vật trong bùn kỵ khí được phá vỡ bằng cách kết hợp cả tác động cơ học và hóa học. Khoảng 25 mg bùn kỵ khí (sau ly tâm) được rửa bằng nước muối sinh lý (NaCl 0,98%) trong các ống Eppedorf. Bổ sung vào mỗi ống 0,5 ml DNAzol (Invitrogen), 0,3 ml hạt thủy tinh đường kính 0.2-0.5 mm (Roth, Đức). Các ống được lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút và sau đó ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút. Chuyển 150ml dịch nổi sang ống mới và kết tủa ADN bằng cách bổ sung 75ml cồn tuyệt đối. Các ống sau đó được đặt trên đá lạnh trong 5 phút và ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút. ADN được rửa một lần bằng cồn 70%. Sau khi làm khô, bổ sung 50ml nước vào mỗi ống. Dung dịch thu được có thể sử dụng làm khuôn cho PCR.
PCR và DGGE
Hệ vi sinh vật bùn kỵ khí được khảo sát thông qua việc khuyếch đại khoảng 400 nucleotid gần đầu 3’ của 16S rDNA. Các mồi được thiết kế riêng rẽ cho vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Kẹp GC (GC clamp) được bổ sung vào đầu 5’ của mồi 3’. Trình tự mồi được thể hiện trong bảng 1.
Phân đoạn dài 400 nucleotid của vi khuẩn và vi khuẩn cổ được khuyếch đại riêng rẽ sử dụng Platinum HiFi SuperMix (Invitrogen). Chương trình nhiệt được thiết lập với pha kích hoạt và biến tính ở 950C trong 10 phút kế tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (940C trong 30 giây, 600C trong 40 giây và 720C trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 720C trong 7 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích trong gel polyacrylamide 9% (37.5:1 acrylamid: bisacrylamide), 20 cm x 20 cm với gradien biến tính từ 40% tới 70% trong x1TAE ở 60oC, điện áp 70V trong 16 giờ, sử dụng thiết bị DGGE 6 lít của Scie-Plas (Anh). Sau khi phân tích, gel được ngâm trong nước cất 30 phút để loại bỏ chất biến tính sau đó, được nhuộm bằng ethidium bromide x0.5 mg/ml trong xl0.5 TAE. Các băng được hiển thị dưới ánh sáng tử ngoại ở 302 nm và hình ảnh được lưu giữ bằng máy ảnh kỹ thuật số Olympus, Camedia 4000Z (Nhật Bản).
Định danh các băng
Các băng đại diện được cắt khỏi gel trong điều kiện UV yếu. Băng cắt rời được đặt vào ống Eppendorf và rửa bằng x0.5 TAE, nước cất, 2-propanol và sau đó làm khô trong không khí. Khoảng 70ml hạt thủy tinh, 50ml nước cất được bổ sung vào mỗi ống. Miếng gel được nghiền bằng chầy nhựa nhỏ. Các ống được bổ sung thêm 100 ml nước cất, lắc ở 14oC, 1400 vòng/phút trong 1 giờ và sau đó để qua đêm trong tủ 4oC. Sau đó, ống được ly tâm ở 1000 g trong 5 phút và dịch trong được sử dụng làm khuôn. Các băng được khuếch đại lại sử dụng cùng cặp mồi như trong phản ứng PCR đầu. Sản phẩm PCR sau đó được tinh chế bằng QIAEXII (Qiagen). Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 377 của Hãng Applied Biosystem được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National Center for Biotechnology) Information, Bethesda, Mỹ (http://www.ncbi.nlm. nih.gov). Các chuỗi liên quan được chuyển tải về, sau đó được xử lý bằng phần mềm BioEdit [1] và so sánh bằng ClustalW.
Kết quả và bàn luận
Để có một đánh giá khái quát về sự hình thành và phát triển của hệ vi sinh vật bùn kỵ khí, Viện CNTP đã tiến hành thu thập các mẫu bùn trong tank kỵ khí từ lúc hệ thống bắt đầu khởi động cho tới lúc ổn định. Quá trình này kéo dài khoảng 3 tháng. Trong tuần đầu, bùn hoạt tính chưa hình thành, vì vậy thời điểm lấy mẫu đầu tiên được tiến hành bắt đầu từ tuần thứ 2. Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Khi hệ thống hoạt động ổn định (theo đánh giá bằng các chỉ tiêu hóa lý), sẽ tiến hành phân tích đồng loạt các mẫu thu thập được. ADN từ các mẫu bùn kỵ khí được tách chiết và sau đó 16S rDNA được khuyếch đại bằng các cặp mồi cho vi khuẩn (Eubacteria) và cổ vi khuẩn (Archaebacteria).
Kết quả khuếch đại sản 16S rDNA cho vi khuẩn và cổ vi khuẩn tạo ra những băng khá đặc hiệu. Chúng tôi nhận thấy có sự biến thiên về lượng sản phẩm PCR khuyếch đại được theo thời gian và điều này được giải thích bởi nồng độ ADN đích. Trong những tuần đầu, sản phẩm PCR cho cổ vi khuẩn khuyếch đại được rất thấp và tăng dần tới khi hệ thống gần ổn định. Đây cũng là điều dễ hiểu vì trong thời gian đầu của quá trình hình thành bùn hoạt tính, hoạt động sinh metan (do cổ vi khuẩn chịu trách nhiệm) thường rất thấp. Trong thời gian tiếp theo, khi lượng khí metan sinh ra lớn hơn, các băng cổ vi khuẩn cũng hiện ra rõ nét hơn. Lượng vi khuẩn (eubacteria) cũng có một mức độ biến thiên nhất định dù kém rõ nét. Mức độ hiện hữu của vi khuẩn hầu như trái ngược lại với cổ vi khuẩn, nghĩa là trong thời gian đầu vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo và sau đó là cổ vi khuẩn.
Kết quả phân tích DGGE sản phẩm khuyếch đại 16S rDNA cho vi khuẩn và cổ vi khuẩn trong bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải bia cho thấy, thành phần hệ vi sinh vật rất đa dạng. Theo đánh giá sơ bộ, có đến vài chục loài vi sinh vật tham gia vào hệ sinh thái. Sự kế thừa và thay đổi cường độ của các băng cũng chỉ rõ động học phát triển của từng nhóm vi sinh vật. Điều ghi nhận ngay lập tức là độ đa dạng của vi khuẩn trong bùn họat tính cao hơn rất nhiều so với cổ vi khuẩn. Sự biến thiên của các dạng vi khuẩn cũng khá phức tạp. Ngoại trừ mẫu bùn kỵ khí trong thời điểm đầu tiên có một số băng nổi bật, trong suốt quá trình, hệ vi sinh vật biến đổi không ngừng và hầu như không có nhóm nào chiếm ưu thế tuyệt đối. Điều này cũng phần nào phản ánh sự phức tạp của hệ sinh thái bùn kỵ khí. Ngược lại với vi khuẩn, thành phần cổ vi khuẩn tỏ ra kém đa dạng hơn và phát triển tương đối có quy luật.
Để có thể nắm rõ hơn thành phần loài vi sinh vật tham gia, chúng tôi tiến hành cắt một số băng đại diện, khuyếch đại lại, sau đó tinh chế và giải trình tự ADN để xác định loài (hình 1).
Hình 1. Động học cấu trúc hệ vi sinh vật trong bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải công nghiệp sản xuất bia (Xưởng Thực nghiệm Viện Công nghiệp Thực phẩm) được đánh giá bằng phương pháp DGGE. Hình bên trái – phổ DGGE khuyếch đại bởi mồi đặc hiệu cho vi khuẩn (Eubacteria); Hình bên phải - phổ DGGE khuyếch đại bởi mồi đặc hiệu cho cổ vi khuẩn (Archae). Các giếng A, B, C, D, E tương ứng với mẫu bùn sau 1, 3, 5, 7, và 10 tuần hoạt động.
Với các mồi cho vi khuẩn, đúng như mong đợi, chúng tôi chỉ thu nhận được nhóm vi sinh vật dạng này. Đó là những loài: Lactobacillus sp., Veillonella ratti, Streptococcus bovis và Pseudomonas sp. Tương tự như vậy, với cặp mồi cho vi khuẩn cổ, chúng tôi thu nhận được những loài sau: Methanospirillum sp., Methanobrevibacter arboriphilus, Methanobrevibacter sp. và Methanosarcina barkeri. Tất cả loài vi khuẩn cổ xác định được đều thuộc nhóm sinh metan. Dựa trên những tài liệu đã cống bố, đặc tính và vai trò của những vi sinh vật phát hiện được có thể tóm tắt như sau:
(i) Nhóm vi khuẩn:
Lactobacillus sp.,là loại vi khuẩn lactic xuất hiện trong thời điểm từ tuần thứ 3 tới tuần thứ 5 của quá trình khảo sát. Đây là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic trong bùn kỵ khí.
Veillonella ratti, là loài vi khuẩn kỵ khí, có khả năng sinh axit propionic [3]. Có lẽ Veillonella thực sự phổ biến trong nước thải, ít nhất là trên địa bàn Hà Nội. Loại vi khuẩn này đã được phát hiện nhiều lần, cả bằng phương pháp phân lập và DGGE trong bùn kỵ khí tại Nhà máy Sữa Hà Nôi. Theo đánh giá động học thông qua DGGE, Veillonella ratti là thành phần chủ yếu trong phần lớn giai đoạn đầu của quá trình ổn định bùn hoạt tính.
Streptococcus bovis, là một trong những vi khuẩn lactic quen thuộc có mặt trong bùn kỵ khí. Trong nước thải, các vi sinh vật lên men lactic này có thể đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu tiên của quá trình phân giải chất hữu cơ trong điều kiện kỵ khí. Tuy nhiên, một số týp của Streptococcus bovis được biết là cũng gây bệnh cho người [5].
Pseudomonas sp., là loại vi khuẩn hiếu khí, Gram (-). Pseudomonas sp. hầu như chỉ có mặt trong tuần đầu tiên và không phát hiện được trong những tuần kế tiếp. Vi sinh vật này có lẽ là một trong những thành phần được mang theo từ nước thải bởi chúng không phải là đại diện cho quá trình phân hủy kỵ khí.
(ii) Nhóm vi khuẩn cổ:
- Methanospirillum sp., là cổ vi khuẩn Gram âm, hình que cong hoặc sợi dài, chúng có khả năng chuyển động tuy không mạnh. Các chủng Methanospirillum sinh methane từ H2 + CO2 hoặc từ formate, một số chủng có khả năng sử dụng 2-propanol + CO2 hoặc 2-butanol + CO2. Chúng không có khả năng phát triển hoặc sinh metan từ acetate, methanol, ethanol, pyruvate hoặc benzoate. Dạng cổ vi khuẩn này chỉ có mặt trong giai đọan cuối và không chiếm số lượng lớn trong bùn kỵ khí.
- Methanosarcina barkeri, là loại cổ vi khuẩn sinh metan. Tế bào của chúng không chứa peptidolglycan hoặc pseudomurein. Lipid tế bào chứa myo-inositol, ethanolamine và glycerol trong phần phân cực. Chúng có tế bào dạng phân cắt nhiều phía, không có khả năng chuyển động. Methanosarcina barkeri có khả năng sử dụng và sinh metan từ acetate, methanol, methylamines, CO, H2 [2]. Theo các đặc điểm hình thái đã công bố và so sánh với những gì có thể quan sát qua kính hiển vi, cũng như theo đánh giá bằng DGGE, thì có lẽ dạng cổ vi khuẩn sinh metan này là dạng phổ biến nhất trong bùn kỵ khí tại các nhà máy bia.
Methanobrevibacter spp., là nhóm vi khuẩn sinh metan có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá trình xử lý nước thải từ nhà máy bia. Có ít nhất hai loài thuộc chi Methanobrevibacter được phát hiện trong hệ thống. Đó là M. arboriphilus và Methanobrevibacter sp. Có lẽ, chúng đóng vai trò quan trọng cho quá trình ổn định của hệ thống. M.arboriphilus từng được phát hiện trong hệ thống xử lý kỵ khí nước thải sản xuất cồn.[4]
Như vậy, bằng kỹ thuật DGGE, chúng tôi đã xác định được động học của quá trình hình thành bùn kỵ khí trong hệ thống xử lý nước thải nhà máy bia. Các số liệu cho thấy, vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn đóng vai trò chủ yếu trong quá trình phân hủy chất hữu cơ, sinh axit, có độ đa dạng cao cũng như biến động lớn trong quá trình hình thành bùn họat tính. Một trong những vi sinh vật phổ biến và quan trọng của nhóm là các loài thuộc chi Veillonella. Vi sinh vật sinh metan xuất hiện trong giai đoạn sau với số lượng tăng dần, nhưng giảm dần sự đa dạng. Thực tế cho thấy, mặc dù không nuôi cấy được, nhưng kỹ thuật DGGE, giải trình tự và phân tích dữ liệu kết hợp với các quan sát hình thái, có thể giúp ích cho việc đánh giá thực trạng của hệ sinh thái.q
Tài liệu tham khảo
Hall, T.A. (1999) BioEdit alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT a user-friendly biological sequence. Nucleic Acids Symp. 41, 95–98.
Kendall, M.M., Boone, D.R. (2001) The Order Methanosarcinales. in M. Dworkin et al., eds., The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, 3rd edition, Springer-Verlag, New York.
Sato, T., Sato, M., Matsuyama, J., Hoshino, E. (1997) PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of genes coding for 16S rRNA in Veillonella spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1268-1270.
Savant, D. V., Y. S. Shouche, S. Prakash, and D. R. Ranade; 2002. Methanobrevibacter acididurans sp. nov., a novel methanogen from a sour anaerobic digester Int. J. Syst. Bacteriol., vol. 52, pp. 1081–1087
Whitehead, T.R., Cotta, M.A. (2000) Development of molecular methods for identification of Streptococcus bovis from human and ruminal origins. FEMS Microbiol. Lett. 182, 237-240.
Whitman, W.B., Bowen, T.L., Boone, D.R., (2001) The Methanogenic Bacteria in M. Dworkin et al., eds., The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, 3rd edition, Springer-Verlag, New York.
