Nghiên cứu chiết xuất và khảo sát tính kháng khuẩn của tinh dầu lá ngũ trảo (Vitex Negundo Linn.)

TÓM TẮT:

Bài viết nghiên cứu chiết xuất và khảo sát tính kháng khuẩn của tinh dầu lá ngũ trảo. Trong nghiên cứu này, tinh dầu được chiết xuất từ lá ngũ trảo (Vitex negundo Linn.) và thử hoạt tính kháng khuẩn. Quy trình chiết xuất tinh dầu tối ưu ứng với 200g mẫu lá ngũ trảo tươi được chiết trong 200mL nước (g/mL) chứa NaCl 5% ở nhiệt độ chiết 130^oC và thời gian chưng cất là 3 giờ với hiệu suất cao nhất là 0.2156%. Thành phần của tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS, phát hiện khoảng 20 hợp chất chính (monoterpene, diterpene, sesquiterpene, Eucalyptol, caryophyllene, naphthalene…). Tính kháng khuẩn của tinh dầu lá ngũ trảo được xác định bằng phương pháp Ariole và Nyeche trên 2 loại vi khuẩn thử nghiệm. Kết quả khảo sát cho thấy tinh dầu lá ngũ trảo kháng vi khuẩn Vibrio vulnificus.

Từ khóa: Cây ngũ trảo, chiết xuất, tính kháng khuẩn, tinh dầu, Vitex negundo Linn., Vibrio vulnificus.

1. Giới thiệu

Cây ngũ trảo (Vitex Negundo Linn.) hay còn gọi là hoàng kinh, chân chim thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae), có nguồn gốc ở Madagascar, châu Phi, châu Á và Phillipines. Hiện nay, loại cây này đã được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia. Ngũ trảo là một trong những loài cây quen thuộc trong đời sống người dân, là vị thuốc chữa trị hiệu quả các loại bệnh thông thường như cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi và nhiều bệnh khác. Ngoài ra, ngũ trảo có tác dụng kháng sinh, kháng nấm và chống oxy hóa mạnh đối với một số loại vi khuẩn (Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương và ctv., 2006).

Ngày nay, tinh dầu lá ngũ trảo đã được nghiên cứu, chiết xuất và ứng dụng trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm ở nhiều nước trên thế giới. Ấn Độ là quốc gia đi đầu trong việc điều chế thuốc có nguồn gốc từ cây ngũ trảo [3, 6]. Ở Việt Nam, cây ngũ trảo thường chỉ được dùng trị bệnh trong dân gian, mặc dù có nhiều ứng dụng song vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu sâu về tinh dầu của cây ngũ trảo trong việc điều chế thuốc.

Xuất phát từ những nhu cầu thực tế chung đó, bài viết tập trung nghiên cứu tìm ra điều kiện tối ưu trong việc tách chiết tinh dầu, xác định các thành phần hóa học và ứng dụng tính kháng khuẩn của tinh dầu, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng cho loại cây này.

2. Phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu: Lá cây ngũ trảo được thu hái trực tiếp tại xã Hòa Lợi, TP. Trà Vinh. Chọn lá từ các đoạn thuần dưỡng 3 - 4 tháng, đã được xử lý sơ bộ và rửa sạch trước khi tiến hành chiết tinh dầu.

Phương pháp ly trích tinh dầu: Tinh dầu lá ngũ trảo được chưng cất bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng hệ chưng cất tinh dầu Clevenger [1]. Đồng thời, khảo sát các điều kiện tối ưu trong quá trình chiết như: nhiệt độ chưng cất, tỉ lệ nước/nguyên liệu, nồng độ NaCl trong nước ngâm, thời gian ngâm nguyên liệu và thời gian chưng cất hỗn hợp.

Phương pháp xác định chỉ số hóa lý: Mẫu tinh dầu thu được tiến hành xác định độ trong, màu sắc, mùi, vị và tỷ trọng của tinh dầu [2].

Phân tích thành phần hóa học: Thành phần hóa học và hàm lượng các cấu tử có trong tinh dầu được xác định bằng máy sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS, thực hiện tại phòng Vật liệu Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP. Hồ Chí Minh.

Phương pháp phân tích tính kháng khuẩn Vibrio vulnificus và Vibrio parahaemolyticus: Mẫu tinh dầu được khảo sát đặc tính kháng vi khuẩn Vibrio vulnificus và vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, mẫu thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Phân tích kiểm nghiệm TVU bằng phương pháp Ariole và Nyeche [4] được công nhận theo ISO/IEC 17025:2005.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Khảo sát các điều kiện tối ưu trong quá trình chiết tinh dầu

Tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu: nhiệt độ chưng cất (^oC), tỉ lệ khối lượng nước/nguyên liệu (mL/g), nồng độ NaCl (%), thời gian ngâm nguyên liệu (phút), thời gian chưng cất (h) dựa vào hàm lượng tinh dầu thu được sau quá trình chưng cất.

Khảo sát nhiệt độ chưng cất tinh dầu với 200 g mẫu lá ngũ trảo tươi đến khi thu được tinh dầu sản phẩm, cố định các yếu tố tỉ lệ khối lượng nước/nguyên liệu, nồng độ NaCl, thời gian ngâm nguyên liệu và thời gian chưng cất. Kết quả được thể hiện tại Bảng 1 và Hình 1.

Hình 1: Hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo thu được theo nhiệt độ chưng cất (^oC)

Bảng 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chưng cất đến hàm lượng tinh dầu

Bảng 1 và Hình 1 cho thấy, ở nhiệt độ 130^oC thì hàm lượng tinh dầu thu được cao nhất. Khi thực hiện quá trình chưng cất ở nhiệt độ quá thấp sẽ không cung cấp đủ nhiệt để đun nóng hỗn hợp nên hơi nước và tinh dầu không bị lôi cuốn đi. Vì vậy, sẽ cần một lượng nhiệt vừa đủ để hỗn hợp nóng và sôi lên. Ngược lại, nếu nhiệt độ chưng cất quá cao sẽ làm phân hủy tinh dầu, làm cho chất lượng tinh dầu giảm xuống. Do đó, nhiệt độ tối ưu được chọn là 130⁰C để làm thí nghiệm tiếp theo.

Thực hiện khảo sát tỉ lệ khối lượng nước/nguyên liệu ở các tỉ lệ khác nhau. Kết quả được thể hiện tại Bảng 2 và Hình 2.

Hình 2: Hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo thu được theo tỉ lệ nước/nguyên liệu

Bảng 2. Ảnh hưởng của tỉ lệ nước/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu

Từ kết quả trên cho thấy, việc xác định tỉ lệ nước và nguyên liệu phù hợp là yếu tố quyết định lượng tinh dầu thu được. Tỉ lệ nước nhiều ảnh hưởng đến tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được. Thể tích dung môi chiết quá nhiều sẽ làm tinh dầu khuếch tán không tốt, lượng tinh dầu được lôi cuốn theo hơi nước thấp, hao tốn năng lượng và tinh dầu dễ ngả sang màu vàng làm cho chất lượng tinh dầu giảm xuống. Vì thế, sau kết quả đã khảo sát được, tỉ lệ nước/nguyên liệu 1/1 (mL/g) là tối ưu nhất.

Khảo sát lượng NaCl (%) cho vào để ngâm nguyên liệu với các nồng độ khác nhau trong quá trình chưng cất. Kết quả được thể hiện tại Bảng 3 và Hình 3.

Hình 3: Hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo thu được theo nồng độ NaCl %

Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu

Kết quả khảo sát đã chứng tỏ hàm lượng tinh dầu tăng khi có sự hiện diện của NaCl và tối ưu nhất ở nồng độ muối NaCl 5%. Điều đó cho thấy, NaCl đóng vai trò như chất xúc tác làm tăng khả năng thẩm thấu của nước vào nguyên liệu do sự chênh lệch nồng độ của môi trường bên trong lá và môi trường bên ngoài, thúc đẩy quá trình chưng cất diễn ra dễ dàng và nhanh chóng hơn. Tuy nhiên, lượng NaCl cho vào dung dịch chưng cất phải phù hợp. Nếu cho ít NaCl thì quá trình chưng cất sẽ diễn ra chậm, gây hao tốn năng lượng. Còn lượng NaCl quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng nhũ tương hóa tinh dầu, vì nồng độ muối cao làm cho các chất béo trong lá bị nhũ hóa.

Tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu lên hiệu suất chưng cất tinh dầu. Kết quả thể hiện ở Bảng 4 và Hình 4.

Hình 4: Hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo theo thời gian ngâm (phút)

Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu

Với thời gian ngâm 90 phút cho lượng tinh dầu thu được tối ưu. Đó là khoảng thời gian phù hợp để tạo sự thẩm thấu cho tinh dầu thoát ra môi trường ngoài, nên khi chưng cất tinh dầu thu được nhiều.

Tiến hành khảo sát thời gian chưng cất khác nhau. Kết quả được thể hiện tại Bảng 5 và Hình 5.

Hình 5: Hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo thu được theo thời gian chưng cất (h)

Bảng 5. Ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu

Từ kết quả cho thấy, hàm lượng tinh dầu lá ngũ trảo thay đổi ở các mức thời gian khác nhau. Ở thời gian chưng cất là 3 giờ thì hàm lượng tinh dầu thu được đạt giá trị cao nhất so với các mức thời gian chưng còn lại. Sau 3 giờ, hàm lượng tinh dầu không tăng hoặc giảm. Thời gian chưng cất đóng vai trò quyết định lượng tinh dầu thu hồi được. Nếu chưng cất trong thời gian quá ngắn, lượng tinh dầu chiết tách chưa hết hoàn toàn. Ngược lại, khi chưng cất vượt quá thời gian tối ưu làm tốn thời gian, tổn hao năng lượng và ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu do xảy ra hiện tượng nhũ tương hóa các dầu béo. Vì vậy, chọn 3 giờ là thời gian chưng cất tối ưu.

Điều kiện tối ưu cho quá trình chiết tinh dầu lá ngũ trảo bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được thể hiện trong Bảng 6.

Bảng 6. Điều kiện tối ưu cho quá trình chiết tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

3.2. Xác định chỉ số hóa lý của tinh dầu lá ngũ trảo

Chỉ số hóa lý của tinh dầu lá ngũ trảo được thể hiện trong Bảng 7.

Bảng 7. Chỉ số hóa lý của tinh dầu lá ngũ trảo

3.3. Thành phần hóa học trong tinh dầu lá ngũ trảo

Kết quả khảo sát thành phần hóa học trong tinh dầu thể hiện trong Bảng 8.

Bảng 8. Thành phần hóa học trong tinh dàu lá Ngũ trảo

Từ kết quả GC/MS đã cho thấy trong tinh dầu lá ngũ trảo có khoảng 20 hợp chất, các thành phần chiếm tỉ lệ cao nhất trong tinh dầu lá ngũ trảo là: Caryophyllene, Eucalyptol, Naphthalene, 1,2,3,5,6,7,8,8a-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-, [1S-(1α, 7α, 8aα)]-. Trong đó: Caryophyllene chiếm 18.336%, cao nhất trong tinh dầu lá ngũ trảo. Trong y học, caryophyllene có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, giảm đau; làm ức chế các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Ngoài ra, nó còn giúp thư giãn, giảm cảm giác căng thẳng. Do đó, caryophyllene với hàm lượng cao đã chứng minh được ưu điểm kháng khuẩn vượt trội của tinh dầu sản phẩm (Saad S. et al, 2015). Eucalyptol chiếm 17.307% trong tinh dầu, dùng để tạo vị và hương, là thành phần tạo mùi thơm và vị hăng dễ chịu cho tinh dầu. Eucalyptol được sử dụng trong các chất tạo mùi, tạo vị và trong mỹ phẩm. Còn trong y học, eucalyptol là thành phần trong nhiều loại nước súc miệng và thuốc ho. Nó được sử dụng như là một loại thuốc trừ sâu và thuốc xua côn trùng (James A. et al, 1987). Ngược lại, eucalyptol là một trong nhiều hợp chất hấp dẫn các con đực của nhiều loài ong lan (Euglossini), dường như chúng thu thập hợp chất này để tổng hợp các pheromon. Do vậy, hợp chất này thường được sử dụng làm mồi nhử để thu hút và thu thập những con ong cho mục đích nghiên cứu (Schiestl F.P. and Roubik D.W, 2003). Naphthalene, 1,2,3,5,6,7,8,8a-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-, [1S-(1α, 7α, 8aα)]- chiếm 14.777% trong tinh dầu, được biết là có tác dụng chăm sóc sức khỏe, trị ho và đờm, giải độc cơ thể, tăng cường khả năng miễn dịch của con người, giảm đau và kháng viêm [5].

3.4. Tính kháng khuẩn của tinh dầu lá ngũ trảo

Khảo sát tính kháng khuẩn Vibrio vulnificus của tinh dầu lá ngũ trảo bằng cách tạo môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vibrio vulnificus. Sau đó, tiến hành đục 5 lỗ trên bề mặt đĩa thạch, nhỏ 50 µL nước cất vào 1 lỗ thạch, 50 µL vi khuẩn Vibrio vulnificus vào 1 lỗ thạch, 50 µL tinh dầu lá ngũ trảo vào mỗi lỗ thạch còn lại. Thí nghiệm được lập lại với khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Quan sát thí nghiệm trong thời gian 2 tuần và ghi nhận kết quả.

Kết quả thí nghiệm kháng khuẩn Vibrio vulnificus và Vibrio parahaemolyticus của tinh dầu lá ngũ trảo cho thấy: đối với môi trường nước, ở phần rìa xung quanh bên ngoài và bên trong giọt nước có màu xanh đặc trưng của vi khuẩn Vibrio vulnificus và màu tím của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Điều đó chứng tỏ rằng, trong môi trường nước vi khuẩn vẫn sống và phát triển bình thường. Đối với môi trường tinh dầu lá ngũ trảo, xung quanh giọt tinh dầu có vùng trắng lan ra, hoàn toàn không nhận thấy được dấu hiệu màu xanh đặc trưng của vi khuẩn Vibrio vulnificus và màu tím đặc trưng của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Điều đó chứng tỏ rằng, tinh dầu lá ngũ trảo kháng vi khuẩn Vibrio vulnificus và vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Tuy nhiên, khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là yếu.

4. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu quá trình chiết xuất tinh dầu từ lá ngũ trảo bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, ở quy mô phòng thí nghiệm, đề xuất điều kiện về nhiệt độ chưng cất tối ưu là 130⁰C, tỉ lệ khối lượng nước/nguyên liệu 1/1 (mL/g), nồng độ dung dịch NaCl là 5%, thời gian ngâm nguyên liệu là 90 phút, thời gian chưng cất là 3 giờ. Tinh dầu được chiết xuất từ lá ngũ trảo với các điều kiện tối ưu có hàm lượng 0.2156%. Tinh dầu thu được từ phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có màu vàng hổ phách, trong suốt, nhẹ hơn nước, vị đắng, mùi hăng và nồng. Thành phần hóa học trong tinh dầu của lá ngũ trảo chủ yếu là các hợp chất: monoterpene, diterpene, sesquiterpene, Eucalyptol, caryophyllene, naphthalene… Hơn nữa, tinh dầu lá ngũ trảo còn kháng được vi khuẩn Vibrio vulnificus, kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus yếu.

Đề xuất nghiên cứu và cô lập các thành phần trong tinh dầu lá ngũ trảo và cao ngũ trảo từ bã chiết để nghiên cứu chiết tách và cô lập các chất đó, để phục vụ cho lĩnh vực y học, khảo sát các yếu tố về thổ nhưỡng, điều kiện canh tác, nghiên cứu các phương pháp chiết khác nhau: chưng cất bằng nước có hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm, chiết bằng CO₂ siêu tới hạn… để tăng hàm lượng tinh dầu sản phẩm n

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Bộ Y tế, 2004. Dược điển Việt Nam (tập 1). NXB Y học. Hà Nội, trang PL-234.
2. Tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 189:1993. Tinh dầu - phương pháp thử.
3. Anisha, S.*, Pramod, K.S., Vipin, K.G., Sharad, V., 2011. Extraction and analysis of essential oil of Nirgundi (Vitex negundo L.). Pelagia Research Library. 2 (4), 262-266.
4. Ariole C. N., Nyeche G. E., 2013. In vitro antimicrobial activity of Lactobacillus isolates against shrimp (Penaeus monodon) pathogens. International Journal of Biosciences. 3(1), 7-12.
5. Juntao Chen, 2018. GC-MS explores the health care components in the extract of Pterocarpus pedatus Pierre. Saudi Journal of Biological Sciences. 25, 1183-1188.
6. Mohankumar, Raju S., Dharani J. and Ravi S.*, 2017. Essential Oil Composition of Vitex negundo, Acetylcholine Esterase Inhibition Activity and Molecular Docking Studies against Bacterial Proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 9(10), 1677-1681.

A STUDY ON THE ESSENTIAL OIL EXTRACTED FROM Vitex negundo Linn.

• Master. NGUYEN THI ANH THU

Faculty of Applied Chemistry, Tra Vinh University

• NGUYEN CAM LAI

Faculty of Medicine, Kien Giang Province Medical College

• MAI THI THUY LAM - THAI BAO TRAN - HUYNH THI MAI TRAN

Tra Vinh University

• Master. NGUYEN THI MY THAO

Faculty of Medicine - Pharmacy, Tra Vinh University

ABSTRACT:

This paper studies on the essential oil extracted from Vitex negundo Linn. In this study, the essential oil was extracted from Vitex negundo Linn. leaves and evaluated its antibacterial activity. 200 g of Vitex negundo Linn. leaves were extracted with 200 mL of water in 5% NaCl under optimal conditions at 130oC for 3 hours to yield 0.2156% of essential oil. This essential oil was analyzed by GC/MS to obtain 20 compounds including monoterpene, diterpene, sesquiterpene, Eucalyptol, caryophyllene, naphthalene, etc. The antimicrobial activity of Vitex negundo Linn. leaves was tested by two kinds of pathogenic bacterias, namely Ariole and Nyeche methods. The results indicated that the essential oil extracted from Vitex negundo Linn. leaves resists Vibrio vulnificus.

Keywords: Vitex negundo Linn., extraction, antimicrobial activity, essential oil.

Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ số 6 tháng 4/2020