Nghiên cứu quá trình trích ly chlorophyll từ bèo tấm (Lemnoideae) bằng dung môi

TÓM TẮT:

Bài viết nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số công nghệ như loại dung môi, nồng độ dung môi sử dụng, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian xử lý đến quá trình trích ly chlorophyll từ bèo tấm. Kết quả cho thấy, aceton cho hiệu quả trích ly cao nhất trong ba loại dung môi. Đặc biệt, tại điều kiện trích ly aceton 80%, tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 trong 8 giờ, hàm lượng chlorophyll đạt 9,21 mg/g chất khô cao gấp 1,1 lần so với dung môi ethanol 90% và 5,5 lần so với dung môi nước.

Từ khoá: Bèo tấm, Lemnoideae, chlorophyll, trích ly dung môi.

1. Đặt vấn đề

Bèo tấm Lemnoideae là một trong những loại thực vật thủy sinh phổ biến nhất ở nước ta. Theo đó, Việt Nam đã phát hiện 3 loài bèo tấm thuộc 3 chi khác nhau (Spirodela, Lemna, Wolffia), đó là loài L. aequinoctialli, S.polyrrhiza và W.globosa, chúng có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh trong các điều kiện nuôi trồng bình thường mà không cần đến các điều kiện đặc biệt như bảo quản lạnh, chế độ vô trùng,… hoặc mọc hoang dại ở các nơi như sông, ao, hồ,...[1] Nhiều người xem đây là loài thực vật gây nên sự xâm chiếm lãnh thổ do tốc độ sinh sản nhanh. Do vậy. nguồn nguyên liệu dồi dào này chủ yếu được tận dụng làm thức ăn cho cá, gia cầm và lợn. Tuy chỉ là một loại nguyên liệu có hiệu quả kinh tế thấp, sản lượng dồi dào, nhưng bèo tấm Lemnoideae chứa rất nhiều protein, chất màu (chlorophyll), chất khoáng, vitamin,… và là nguồn tài nguyên hàng đầu được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu, sử dụng.

Hiện nay, chất màu là một loại phụ gia rất quan trọng không chỉ trong chế biến thực phẩm, mà còn được dùng trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm. Nhu cầu sử dụng chất màu ở nước ta rất lớn, Việt Nam hiện chưa sản xuất được nhiều mà phải nhập khẩu từ nước ngoài. Để phòng ngừa tác hại của chất màu hoá học, các nhà khoa học đang hướng tới chất màu có nguồn gốc tự nhiên. Loại chất màu này ít độc hại, màu sắc hấp dẫn, thân thiện với môi trường, phù hợp với xu hướng phát triển bền vững.

Bài viết đánh giá ảnh hưởng các yếu tố liên quan đến quá trình trích ly chlorophyll từ bèo tấm bằng dung môi như loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nồng độ dung môi và thời gian trích ly. Đây chính là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn cũng như tối ưu hóa quá trình trích ly chlorophyll và tạo ra chất màu tự nhiên từ bèo tấm.

2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu

Bèo tấm được thu mua từ ao nuôi tại xã Nhật Tảo, huyện Tân Trụ, tỉnh Tiền Giang. Sau đó, bèo tấm được rửa sạch và loại bỏ các tạp chất. Tiếp đến, chúng được sấy đối lưu ở nhiệt độ 50^oC trong 8 giờ đến độ ẩm nhỏ hơn 10%. Bèo khô được xay, rây qua rây 0,3mm. Phần qua rây được bảo quản trong các túi, tối màu, tránh ánh sáng trực tiếp. Các hóa chất khác đạt các yêu cầu cơ bản của hóa chất dùng trong phân tích.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu quá trình trích ly chlorophyll bằng dung môi

Quá trình nghiên cứu được tiến hành khảo sát ảnh hưởng của 3 loại dung môi là nước, ethanol và aceton với các thông số công nghệ như nồng độ sử dụng, tỉ lệ nguyên liệu dung môi và thời gian xử lý. Quy trình thực hiện chung như sau: 5 gram bèo tấm được bổ sung dung môi với nồng độ và tỉ lệ xác định, sau đó ủ ở 35^oC để tiến hành trích ly trong một khoảng thời gian xác định. Mẫu sau khi trích ly được ly tâm để thu lấy dịch và phân tích hàm lượng chlorophyll.

2.2.2. Phương pháp phân tích

Hàm lượng chlorophyll trong mỗi dung dịch được xác định bằng phương pháp quang phổ so màu theo nghiên cứu của Porra (2002) và Li cùng cộng cự (2005) [2,3]. Công thức xác định như sau:

Với A₆₄₅ và A₆₆₃ là mật độ quang của mẫu khi đo ở bước sóng tương ứng 645nm và 663nm.

2.2.3. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu

Trong nghiên cứu này, mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày ở dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Số liệu thực nghiệm được xử lí bằng phần mềm Microft Office Excel 2019 và phần mềm thống kê Minitab 19.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi

Tổng lượng chlorophyll cao nhất trích ly bằng 3 dung môi (acetone, ethanol và nước) ở các nồng độ khác nhau là 7,49±0,04 mg/g trong ethanol 90%, 8,71±0,17 mg/g trong acetone 80%, 1,34±0,03 mg/g trong nước (Bảng 1). Hàm lượng Chl-a, Chl-b và Chl-ab tăng tỉ lệ thuận với tăng nồng độ dung môi và đạt giá trị cao nhất ở ethanol 90% và acetone 80%. So mới dung môi acetone, khi dùng dung môi ethanol, nồng độ Chl-a luôn đạt giá trị cao hơn và chiếm khoảng 66 - 69% so với tổng lượng chlorophyll có trong dung dịch. Tuy nhiên, Chl-ab thu được từ dung môi ethanol lại nhỏ hơn so với lượng Chl-ab thu được từ dung môi acetone. Hơn nữa, nồng độ Chl-a, Chl-b và Chl-ab tăng dần theo nồng độ acetone và ethanol do màng tế bào có tính chất của thẩm tích. Nó cho dung môi khuếch tán vào bên trong tế bào và cho các sắc tố màu tan trong dung môi đi qua, giữ lại các phân tử lớn trong tế bào. Màng nguyên sinh chất trong tế bào có tính chất bán thấm chọn lọc chỉ cho dung môi đi vào trong tế bào, hòa tan các sắc tố bên trong.

Ở cây thủy sinh, đặc biệt là các loại bèo Lemanoideae, lá có lớp biểu bì mỏng, các tế bào, bó mạch và các mô cơ học yếu. Hơn nữa, chúng chứa các tế bào mesophyll chloroplastsin lớn nên dễ dàng được trích ly bởi các dung môi hữu cơ phân cực. Mặt khác, nguyên lý trích ly ngược dòng tạo sự chênh lệch nồng độ. Khi chênh lệch nồng độ chất cần chiết giữa 2 pha tiếp xúc nhau, thì tốc độ khuếch tán phân tử qua màng càng mạnh. Khi đó hiệu suất trích ly chlorophyll càng lớn [4].

Bảng 1: Ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ dung môi đến quá trình trích ly thu nhận chlorophyll từ bèo tấm Lemanoideae

1) Chl-a, Chl-b, Chl-ab: Nồng độ (mg/l, trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 3) chlorophyll a, chlorophyll b, và chlorophyll tổng số trong 1 g mẫu trong thí nghiệm được tách chiết ở trong 4 giờ
2) Các chữ khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê theo nồng độ dung môi ở p < 0.05

3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình trích ly chlorophyll

Hình 1 cho thấy, tổng lượng chlorophyll thu được cao nhất trong acetone 80% - tỉ lệ 1:20 w/v (khối lượng nguyên liệu/ thể tích dung môi), ethanol 90% - tỉ lệ 1: 25 w/v và nước - tỉ lệ 1:15 w/v lần lượt là 8,69 ± 0,15 mg/g, 7,88 ± 0,07 mg/g, 1,56 ± 0,06 mg/g. Khi tăng thể tích dung môi thì lượng chất màu thu được càng lớn vì lượng dung môi tăng tạo cơ hội cho các sắc tố màu tiếp xúc nhiều với dung môi dẫn đến khả năng thẩm thấu cao hơn. Nhưng khi tiếp tục tăng thể tích dung môi thì lượng chất màu thu được lại có xu hướng giảm nhẹ, do thể tích dung môi quá lớn có khả năng gây bão hòa và làm giảm lượng chất màu khuếch tán vào dung môi, gây khó khăn và hiệu quả kinh tế kém (tốn năng lượng và thời gian đuổi dung môi). Nếu lượng dung môi ít dẫn đến không đủ để hòa tan, trích ly hết lượng chlorophyll ra khỏi tế bào [5,6] .

Hình 1: Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến quá trình trích ly chlorophyll từ bèo tấm của 3 loại dung môi

Việc bổ sung lượng dung môi chiết tách là rất quan trọng, cần theo một tỉ lệ thích hợp để đạt được hiệu suất chiết tách cao nhất. Theo kết quả thực nghiệm, dung môi acetone 80% ứng với tỉ lệ 1:20, ethanol 90% ứng với tỉ lệ 1:25 và nước ở tỉ lệ 1:15 cho hàm lượng chlorophyll thu nhận là cao nhất. Các kết quả này tiếp tục được sử dụng cho thí nghiệm sau.

3.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chlorophyll

Kết quả thực nghiệm cho thấy, hàm lượng Chl-ab thu nhận cao nhất ở dung môi aceton 80% - tỉ lệ 1:20 là 9,21±0,17 mg/g với thời gian trích ly là 8 giờ; dung môi ethanol 90% - tỉ lệ 1:30 là 8,36 ± 0,13 mg/g với thời gian trích ly là 6 giờ và 1,67 ± 0,01 mg/g đối với nước trích ly trong 8 giờ.

So với mẫu tại 0 giờ, tổng lượng chlorophyll tăng dần theo thời gian trong 8 giờ đầu trích ly với dung môi acetone 80% và trong 6 giờ với dung môi ethanol 90%, sau đó hàm lượng Chl-ab giảm dần theo thời gian trích ly. Thời gian càng dài thì lượng chất màu khuếch tán càng tăng nhưng ở một thời gian nhất định. Khi đã đạt được mức độ trích ly cao nhất nếu kéo dài thời gian thì sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế [7].

Mặt khác, do sử dụng phương pháp ngâm chiết nên điều kiện chiết tách chlorophyll trong thời gian ngắn không mang lại hiệu quả cao. Thời gian ngâm chiết quá dài, lượng dung môi chiết bay hơi đáng kể, đồng thời dẫn đến sự chuyển hóa chlorophyll tạo pheophytin và các đồng phân khác do sự tác động của các yếu tố không thuận lợi, nên làm giảm hàm lượng chlorophyll thu nhận được.

Hình 2: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng chlorophyll

trong 3 dung môi khác nhau

Việc ngâm chiết chlorophyll cho hiệu quả cao nhất sau 8 giờ chiết tách đối với acetone 80% và nước, 6 giờ đối với ethanol 90%. Tóm lại, qua các khảo sát về ảnh hưởng của dung môi đối với việc chiết xuất chlorophyll, thì acetone được xem là dung môi trích ly thích hợp nhất. Các điều kiện phù hợp cho quá trình trích ly chlorophyll được xác định là trong vòng 8 giờ, chiết với nồng độ acetone 80%, tỷ lệ nguyên liệu trong dung môi tương ứng 1:20 w/v.

4. Kết luận

Hàm lượng cholorphyll trích ly được đều đạt giá trị cực đại ở một điều kiện công nghệ nhất định. Việc tăng dần của lượng nồng độ dung môi, tỉ lệ nguyên liệu dung môi và thời gian trích ly đều góp phần tăng cường sự thâm nhập của dung môi và hỗ trợ quá trình khuếch tán chlorophyll ra ngoài. Nước cho hiệu quả trích ly chlorophyll thấp nhất trong cả 3 loại dung môi. Ngược lại, aceton 80% cho khả năng trích ly chlorophyll cao nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Landolt and R. Kandeler. (1986). The family of Lemnaceae: a monographic study, Geobotanischen Institutes der Eidgenossischen Technische Hochschule, Stiftung Rubel, , Vols. 1. R. Porra, W. Thompson, and P. Kriedemann. (1989). Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 975(3), 384-394.
Li, Y. Guo, H. Yun, M. Zhang, X. Gong, and F. Mu. (2005). Methods of chlorophyll determination from maize. Chinese Agricultural Science Bulletin, 21, 153-155.
D. Sculthorpe. (1967). Biology of aquatic vascular plants. New York: Koeltz Scientific Books.
A. Al-Farsi and C. Y. Lee. (2008). Optimization of phenolics and dietary fibre extraction from date seeds. Food Chemistry, 108, 977-985.
Cacace and G. Mazza (2003), Optimization of extraction of anthocyanins from black currants with aqueous ethanol, Journal of food Science, vol. 68, 240-248.
Bin (2005), Các quá trình thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực phẩm (tập 4). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

A study on the process of extracting chlorophyll from chlorophyll from duckweed (Lemnoideae) with solvents

Master. Tran Chi Hai ¹

Master. Ha Thi Thanh Nga ²

Master. Pham Thi My Tien ³

Ph.D. Phan Van Man ⁴

^{1 2 3}Ho Chi Minh City University of Food Industry

⁴Ba Ria – Vung Tau College of Technology

ABSTRACT:

This study examines the effect of some technological parameters such as the solvent types, the concentration level, the ratio of raw material per solvent, the extraction time on the process of extracting chlorophyll from duckweed. This study’s results indicate that the acetone give the highest extraction efficiency among the three studied solvents. Especially when using 80% acetone, the ratio of solvent per raw material of 1: 20 during 8 hours, the content of chlorophyll is 9.21±0.17 mg/g, 1.1 times higher than the content of chlorophyll with 90% acetone and 5.5 times higher than the content of chlorophyll with water.

Keywords: Duckweed, lemnoideae, chlorophyll, solvent extraction.