Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên một số chỉ tiêu hóa lý của dịch lên men cellulose sử dụng vi khuẩn Acetobacter xylinum

TÓM TẮT:

Bài viết nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 100, 200 g/L. Quá trình lên men celulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng và số lượng vi sinh vật trong canh trường lên men. Trong quá trình lên men, vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng. pH không thay đổi đáng kể trong 2 ngày đầu, sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 và không thay đổi ở các ngày cuối quá trình lên men. Ngoài ra, tốc độ thay đổi pH và độ acid tổng ở nồng độ đường 200 g/L cao hơn nồng độ đường 100 g/L và vi sinh vật chuyển qua pha suy vong ở thời gian lên men 12 ngày.

Từ khóa: Men cellulose, độ pH, vi sinh vật, acid acetic, vi khuẩn Acetobacter xylinum.

1. Đặt vấn đề

Cellulose là đại phân tử phong phú nhất trên trái đất và hầu hết cellulose được sản xuất bởi thực vật. Cellulose bao gồm các homopolymer của β-1,4-glucose. Mức độ trùng hợp của cellulose thay đổi từ 100-15000 đơn vị glucose với sự kết tinh của các chuỗi tuyến tính dài để tạo thành các vi sợi của một thực thể tinh thể duy nhất [1]. Ngoài thực vật, cellulose cũng được tìm thấy trong nhiều vi sinh vật như nấm, vi khuẩn và tảo. Báo cáo đầu tiên về cellulose được sản xuất từ vi khuẩn (bacterial cellulose - BC), đặc biệt từ A. xylinum, được công bố vào năm 1996 [2]. Các nghiên cứu gần đây đã tiết lộ BC có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn, bao gồm cả các loại vi khuẩn Gram âm như Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, cũng như vi khuẩn Gram dương như Sarcina ventriculi.

Mặc dù quá trình hình thành cellulose của A. xylinum đã được nghiên cứu khá nhiều trong các nghiên cứu trước đó, hầu hết các nghiên cứu đã giải quyết việc làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp cellulose, và hầu hết các chủng được nghiên cứu cho đến nay chỉ tạo ra một lượng cellulose nhỏ. Hơn nữa, một môi trường tiêu chuẩn được sử dụng để canh tác các sinh vật sản xuất vi khuẩn như môi trường Hestrin-Schramm rất tốn kém và đòi hỏi nhiều nguồn bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy [3]. Nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự thay đổi một số tính chất hóa lý của dịch lên men cellulose sử dụng vi khuẩn A. xylinum.

2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1. Quá trình nhân giống vi sinh vật

Trong nghiên cứu này, môi trường Hestrin-Schramm (HS) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum. Thành phần của môi trường HS bao gồm (g/L): glucose (20.0), peptone (5.0), chất chiết men (5.0), Na₂HPO₄ (2.7), and citric acid monohydrate (1.15) và pH được hiệu chỉnh về giá trị 5.0 [4]. Môi trường được bổ sung thêm ammonium sulfate (4 g/L) để kích thích quá trình tăng sinh khối.

Giống vi khuẩn được nhân giống cấp 1 tại cơ sở sản xuất thạch dừa (Sơn Phú, Giồng Trôm, Bến Tre) trên môi trường nước dừa già có bổ sung ammonium sulfate (4 g/L) và diammonium phosphate (1 g/L) để kích thích tăng trưởng trong khoảng thời gian 3 ngày ở nhiệt độ 30^oC.

Giống vi khuẩn hoạt hóa được nhân giống cấp 2 trên môi trường HS sử dụng tỷ lệ giống cấy 10% ở nhiệt độ 30^oC trong 5 ngày. Sau 5 ngày nhân giống, giống vi khuẩn được cấy vào môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulose ở tỷ lệ giống cấy 10% và tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ 30^oC trong 15 ngày. Sau mỗi ngày lên men, màng cellulose (nếu hình thành) được tách trực tiếp ra khỏi môi trường và được xử lý trước khi xác định khối lượng. Phần dịch lên men còn lại được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu khác bao gồm: pH, độ acid tổng, hàm lượng đường khử, hàm lượng vi khuẩn.

2.2. Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose

Quá trình lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum được thực hiện trên môi trường HS như mô tả trong phần trên với nồng độ cơ chất ban đầu là 100 và 200g/L với tỷ lệ giống cấy 10%. Quá trình lên men tĩnh được thực hiện trong 15 ngày ở nhiệt độ 30^oC. Sau khi quá trình lên men kết thúc, dịch lên men và lớp màng cellulose tạo thành được phân tích xác định các chỉ tiêu hóa lý.

2.3. Phương pháp phân tích

Xác định hàm lượng vi sinh vật: Canh trường (2mL) được định mức lên 10mL sử dụng dung dịch đệm acetate 0.1 M (pH 5.0) có chứa cellulase 1% (v/v) và tiến hành quá trình thủy phân trong 2h ở 50^oC. Sau quá trình thủy phân, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No.2 và hàm lượng vi sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm [5].

Độ acid tổng của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid-base sử dụng dung dịch NaOH 0.05N làm dung dịch chuẩn độ với chỉ thị màu phenolphthalein. Độ acid tổng được biểu diễn theo đơn vị gam acid acetic trong 1 L dịch lên men. pH của dịch lên men được xác định sử dụng pH kế.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu thực nghiệm được phân tích bằng phần mềm SPSS 15 (SPSS Inc. Chicago, U.S.A) sử dụng những kỹ thuật thống kê cơ bản. Phân tích phương sai một nhân tố (one-way ANOVA) được áp dụng để xác định sự khác nhau giữa các chế độ xử lý mẫu và Tukey’s Multiple Range test được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình ở mức ý nghĩa 5%. Tất cả thí nghiệm và những chỉ tiêu phân tích được lặp lại 3 lần.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Sự thay đổi số lượng vi sinh vật

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 100, 200g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi số lượng vi sinh vật trong môi trường lên men.

Hình 1: Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L

Sự thay đổi số lượng vi sinh vật của canh trường lên men với nồng độ cơ chất ban đầu 100 g/L theo thời gian được thể hiện qua Hình 1. Sự phát triển của vi sinh vật tăng đáng kể trong 9 ngày lên men đầu và bắt đầu có xu hướng suy thoái sau ngày thứ 9.

Hình 2: Sự thay đổi số lượng vi sinh vật (mật độ quang ở bước sóng 600 nm) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn  A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L

Ảnh hưởng của thời gian lên men lên số lượng vi sinh vật của canh trường lên men với nồng độ cơ chất ban đầu 200 g/L được biểu thị trong Hình 2. So với môi trường có nồng độ cơ chất thấp hơn 200 g/L, số lượng vi sinh vật của môi trường 200 g/L glucose cao hơn đáng kể.

3.2. Sự thay đổi pH và độ acid tổng

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 100, 200 g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng của dịch lên men. 

Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi pH và độ acid tổng của dịch lên men trong môi trường HS cũng có chiều hướng giảm và giảm mạnh từ ngày 0 đến ngày 7. Do pH giảm nên lượng acid tổng của môi trường tăng.

Sự thay đổi của pH và hàm lượng acid tổng trong dịch lên men cellulose với nồng độ cơ chất 100 g/L được thể hiện qua Hình 3. Kết quả này cho thấy khi pH giảm thì hàm lượng acid tổng trong canh trường lên men tăng [6]. Theo thời gian, hàm lượng acid tăng do vi khuẩn A. xylinum sử dụng đường tham gia vào quá trình chuyển hóa các ethanol thành acid acetic khiến pH giảm và acid tăng [7]. pH không thay đổi đáng kể trong 2 ngày đầu; sau đó giảm đáng kể đến ngày 10 và không thay đổi ở các ngày cuối quá trình lên men.

Hình 3: Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 100 g/L

Kết quả nghiên cứu này cũng được tìm thấy ở báo cáo của Kamide et al. (1990) về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trên sinh tổng hợp cellulose. Báo cáo cho thấy pH không thay đổi cho đến khi 64h lên men và giảm tương đối nhanh trong thời gian 1h tiếp theo. Sau đó, pH giảm chậm và gần như không đổi cho đến 120h và sau đó cho thấy một sự giảm nhanh chóng và không thay đổi cho tới 150h lên men [8].

Vi khuẩn A. xylinum ưa thích môi trường acid nhẹ để tổng hợp cellulose. Do đó, việc tăng giá trị pH môi trường lên men làm giảm đáng kể quá trình tổng hợp cellulose do sự sinh trưởng của vi khuẩn kém trong điều kiện này cũng như việc ức chế các enzyme tham gia vào quá trình hình thành cellulose [4].

Với môi trường có nồng độ cơ chất 200 g/L, khi thời gian lên men tăng lên, có sự gia tăng tổng lượng acid qua từng ngày, tổng lượng acid tăng dần đều trong 14 đầu lên men và tăng mạnh trong ngày 15. Điều này là do A. xylinum có thể chuyển hóa carbohydrate thành acid acetic bằng cách tổng hợp các sợi cellulose.

Quá trình chuyển hóa là hô hấp tế bào, bao gồm quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic và chuyển đổi glucose thành acid gluconic. Acid acetic là sản phẩm phụ của cellulose và có ảnh hưởng đến sự giảm pH trong môi trường nuôi cấy. Sự giảm pH có ảnh hưởng lên cả sự sinh tổng hợp cellulose và sự sinh trưởng của vi sinh vật [9]. Hình 3 cho thấy pH có xu hướng thay đổi không đáng kể từ ngày 0-4 do vi khuẩn mới thích nghi với môi trường và có xu hướng giảm từ ngày 4-6 do nồng độ acid gluconic tăng. Kết quả là, nồng độ acid gluconic cao có thể thay đổi hoạt động của các quá trình trao đổi chất [10].

Trong khoảng thời gian lên men 10-15 ngày, sự oxi hóa glucose tạo thành gluconate đã dẫn đến giảm năng suất cellulose và giảm pH ức chế sự tăng trưởng tế bào và sản xuất cellulose. Những nghiên cứu khác cũng cho thấy khi pH giảm xuống dưới 4.0, quá trình lên men tĩnh tạo ra cellulose bắt đầu xảy ra [11].

Hình 4: Sự thay đổi pH và độ acid tổng (g acid acetic/L) của dịch lên men sinh tổng hợp cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS với hàm lượng glucose ban đầu 200 g/L

Việc điều chỉnh pH môi trường rất quan trọng để thu được hiệu suất thu hồi cellulose cao. Sự oxy hóa glucose bởi enzyme glucose dehydrogenase liên kết màng tế bào tạo nên acid gluconic và làm giảm pH môi trường. Nếu pH môi trường giảm xuống dưới 3.0, quá trình tổng hợp cellulose bị ức chế [12].

4. Kết luận

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình lên men cellulose của vi khuẩn A. xylinum được khảo sát. Nồng độ cơ chất được thay đổi ở các giá trị 100, 200 g/L. Quá trình lên men cellulose được mô tả dựa trên sự thay đổi pH, độ acid tổng trong canh trường lên men. Sự giảm pH và tăng hàm lượng acid tổng của môi trường 200 g/L cơ chất cao hơn đáng kể so với môi trường 100 g/L và vi khuẩn A. xylinum chuyển qua pha suy vong sau 12 ngày lên men.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. D. N.-S. Hon. (1994). Cellulose: A random walk along its historical path. Cellulose, 1(1), 1-25.
2. R. M. Brown Jr. (2004). Cellulose structure and biosynthesis: What is in store for the 21^st century? J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem., 42(3), 487-495.
3. M. Schramm and S. Hestrin. (1954). Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. Microbiology, 11(1), 123-129.
4. J. Ye et al. (2019). Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture mediu. Bioresour. Technol., 274, 518-524.
5. L. L. Zhou, D. P. Sun, L. Y. Hu, Y. W. Li, and J. Z. Yang. (2007). Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 34(7), 483-489.
6. S. Masaoka, T. Ohe, and N. Sakota. (1993). Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. J. Ferment. Bioeng., 75(1), 18-22.
7. M. Gullo, C. Caggia, L. De Vero, and P. Giudici. (2006). Characterization of acetic acid bacteria in ‘traditional balsamic vinegar. Int. J. Food Microbiol., 106(2), 209-212.
8. K. Kamide, Y. Matsuda, H. Iijima, and K. Okajima. (1990). Effect of culture conditions of acetic acid bacteria on cellulose biosynthesis. Br. Polym. J., 22(2), 167-171.
9. A. Seto, Y. Kojima, N. Tonouchi, T. Tsuchida, and F. Yoshinaga. (1997). Screening of bacterial cellulose-producing Acetobacter strains suitable for sucrose as a carbon source. Biosci. Biotechnol. Biochem., 61(4), 735-736.
10. J. K. Park, S. H. Hyun, and J. Y. Jung. (2004). Conversion ofG. hansenii PJK into non-cellulose-producing mutants according to the culture condition. Biotechnol. Bioprocess Eng., 9(5), 383-388.
11. P. G. Verschuren, T. D. Cardona, M. J. R. Nout, K. D. De Gooijer, and J. C. Van den Heuvel. (2000). Location and limitation of cellulose production by Acetobacter xylinum established from oxygen profiles. J. Biosci. Bioeng., 89(5), 414-419.
12. A. Krystynowicz et al. (2005). Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum. ACTA Biochim. Pol. Ed., 52(3), 691-698.

EFFECT OF INITIAL SUBSTRATE CONCENTRATION

ON PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF FERMENTATION

 MEDIUM OF BACTERIAL CELLULOSE BY ACETOBACTER XYLINUM 

• MSc. NGUYEN QUOC DUY

Faculty of Environmental and Food Engineering

 Nguyen Tat Thanh University

ABSTRACT:

This study examines the effect of initial substrate concentration on changes in physicochemical properties of fermentation medium by Acetobacter xylinum. The substrate concentration was changed at the values of 100 and 200 g/L. The fermentation process was described based on the change in pH, total acidity and number of microorganisms in the fermentation broth. During the fermentation process, A. xylinum utilized sugar to converse ethanol into acetic acid, causing the decrease in the pH and the increase in the acidity. The value of pH remained stable in the first two days, then decreased significantly on the tenth day and remained unchanged in the last days of fermentation. In addition, the rate of changes in pH and in the total acidity at the sugar concentration of 200 g/L was higher than that of the sugar concentration of 100 g L and the microorganisms were in the death phase at 12 days of fermentation.

Keywords: Cellulose, pH, microorganisms, acid acetic, Acetobacter xylinum.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 21, tháng 8 năm 2020]