TÓM TẮT:
Tinh dầu ngày nay được nghiên cứu và sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Bài viết nhằm nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) của 4 loại tinh dầu dạng đơn lẻ gồm sả chanh, cam, lài, quế và hỗn hợp của chúng. Kết quả cho thấy, tinh dầu quế và hỗn hợp (sả chanh/lài/quế = 30/60/10 (tỷ lệ % v/v)) thể hiện hoạt tính kháng S. aureus tốt nhất. Từ đó cho thấy tiềm năng sử dụng tinh dầu đơn và hỗn hợp trong ngành Dược phẩm và Mỹ phẩm.
Từ khóa: tinh dầu, hoạt tính kháng khuẩn, Staphylococcus aureus.
1. Đặt vấn đề
Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus (S. aureus) là một vi khuẩn gram dương gây bệnh, được tìm thấy trên da và niêm mạc (thường là vùng mũi) của hầu hết những người khỏe mạnh. Tụ cầu vàng thường không gây nhiễm trùng trên da lành, nhưng khi xâm nhập vào máu hoặc các mô bên trong, những vi khuẩn này có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng nghiêm trọng tiềm ẩn [1].
Kháng sinh là vũ khí quan trọng để chống lại các vi khuẩn gây bệnh, điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi sinh vật. Việc lạm dụng kháng sinh đã dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và trở thành mối lo ngại hàng đầu trong lĩnh vực y tế của nhiều quốc gia [2]. Vì vậy, trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên thay thế cho kháng sinh đang nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới [3].
Tiềm năng kháng khuẩn của các chiết xuất từ thực vật và tinh dầu được phát triển mạnh trên thế giới. Đa số các nghiên cứu này vẫn đang tập trung khai thác tiềm năng kháng khuẩn của các tinh dầu riêng lẻ [4]. Các tinh dầu sả chanh, cam, quế hoặc lài có khả năng kháng lại một số vi sinh vật như Escherichia coli (E.coli), S. aureus, Bacillus subtilis (B. subtilis),… là do có chứa một số hoạt chất như leptospermone, tricyclene, flavesone, myrcene, carvacrol, p-cymene, eugenol, γ-terpinene, phenylpropanoids, β-selinene, calamenene, citral [5, 6]. Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu đã đánh giá khả năng kháng nấm men, nấm mốc hoặc các vi khuẩn gây hư hỏng sản phẩm thực phẩm của hỗn hợp tinh dầu [7, 8].
Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa ẩm, phù hợp trồng nhiều loại cây trồng khác nhau, trong đó có sả chanh, quế, cam, bưởi… Hiện nay, tinh dầu được sử dụng trong đời sống ngày càng nhiều. Các nghiên cứu đa số vẫn tập trung chủ yếu đánh giá tác động của các tinh dầu đơn [9, 10]. Việc khảo sát về thành phần hóa học và đánh giá tác động kết hợp của các tinh dầu trên vẫn còn hạn chế và cần được nghiên cứu nhằm phát triển tiềm năng của hỗn hợp các tinh dầu nhiệt đới Việt Nam. Trong nghiên cứu này, các loại tinh dầu đơn sả chanh, cam, lài, quế và hỗn hợp tinh dầu được xác định thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký khí GC/MS/MS và hoạt tính kháng khuẩn bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn, nuôi cấy trong môi trường lỏng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ ức chế 50% IC50.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng 4 loại tinh dầu đơn, gồm: sả chanh (Mẫu 1), cam (Mẫu 2), lài (Mẫu 3), quế (Mẫu 4), được mua tại Công ty TNHH Tinh dầu thiên nhiên Mêkông (Việt Nam).
Chủng vi khuẩn S. Aureus (ATCC 13709): được nuôi cấy trong môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) và Trypticase Soy Broth (TBS), xuất xứ HiMedia Laboratories - Ấn Độ.
2.2. Phối trộn hỗn hợp tinh dầu
Với 4 loại tinh dầu sả chanh, cam, lài, quế, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phối trộn dựa trên nguyên tắc chế tạo nước hoa theo tỷ lệ (% v/v) [11], cụ thể:
- Mẫu 5: sả chanh/lài/quế với tỷ lệ 30/60/10;
- Mẫu 6: sả chanh/cam/quế với tỷ lệ 30/60/10;
- Mẫu 7: sả chanh/cam/lài/quế với tỷ lệ 30/30/30/10.
2.3. Xác định thành phần hóa học
Xác định thành phần hóa học các mẫu tinh dầu được thực hiện trên máy sắc ký khí GC 8890 đầu dò khối phổ MS/MS 7000D Triple Quadrupole, cột HP MS5 (30m×250µm×0,25µm), khí mang heli (2 mL/phút).
2.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu tinh dầu được thực hiện bằng phương pháp đo vòng kháng khuẩn [12], gồm các bước sau:
- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn S. aureus: trên mặt thạch phân lập, chọn ít nhất từ 3 - 5 khuẩn lạc giống nhau và tách rời. Dùng que cấy chạm vào đầu mỗi khuẩn lạc, cấy chuyển vào 5 mL môi trường TSB rồi ủ ở 37oC trong 2 giờ. Huyền dịch vi khuẩn khi đó có chứa khoảng 1.108 CFU/mL.
- Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch: hút 100 µL dịch khuẩn rồi dùng tăm bông vô trùng cấy ria vi khuẩn lên mặt thạch MHA đã để tủ ấm trước đó 10 - 15 phút.
- Nuôi cấy và đọc kết quả: hút lần lượt 100 µL các mẫu tinh dầu ở các nồng độ khác nhau cho vào các đĩa giấy vô trùng (Φ = 0.5 mm) và đặt cố định lên mặt thạch MHA, sau đó cho vào tủ ấm 37oC để vi sinh vật phát triển trong 24 giờ. Tiến hành đo đường kính vòng kháng khuẩn bằng thước kẻ có độ chia mm. Các mẫu tinh dầu có nồng độ 10%, 20% và 40%, đối chứng dương Ampicillin 5%, đối chứng âm Tween-80 5%.
2.5. Xác định giá trị MIC và IC50
Các mẫu tinh dầu được pha loãng vào môi trường lỏng TSB, sử dụng chất nhũ hóa Tween-80 5% với các nồng độ 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 và 40%. Sau đó hút 20 µL dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào các ống nghiệm trên, lắc đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Giá trị MIC là ống nghiệm có nồng độ tinh dầu thấp nhất mà vi khuẩn không phát triển được (so sánh với ống chuẩn có mật độ 1.108 CFU/mL). Giá trị IC50 được xác định bằng một nửa giá trị MIC.
3. Kết quả và bàn luận
3.1. Thành phần hóa học của các loại tinh dầu
Các mẫu tinh dầu (Mẫu 1 - 7) được phân tích thành phần định tính bằng máy sắc ký khí GC/MS/MS và thu được kết quả như thể hiện ở Bảng 1.
Từ Bảng 1 cho thấy, tinh dầu sả chanh có thành phần chủ yếu là α-citral (44%), β-citral (33,2%) và triacetin (23,8%), tương ứng với các nghiên cứu trước đây [5, 6]. Tinh dầu cam có 10 hợp chất khác nhau với elemol chiếm tỉ lệ vượt trội 28,23% và hexadecanoic acid chiếm 19,82%. Tương tự, tinh dầu hoa lài có thành phần chính là methyl anthranilate (78,45%) và hơn 20% 4 loại hợp chất khác. Coumarin và cinnamaldehyde lần lượt chiếm 33,55% và 15,23% trong tinh dầu được chiết xuất từ vỏ quế [13, 14]. Bên cạnh những thành phần chính có cấu trúc tương tự những nghiên cứu trước đây, còn có một vài sự khác biệt về thành phần hóa học của các tinh dầu đơn, điều này có thể do nguồn nguyên liệu được trồng ở các điều kiện địa lý, khí hậu, thổ nhưỡng khác nhau hoặc do phương pháp chưng cất [15].
Theo kết quả phân tích thành phần bằng GC/MS/MS ở Bảng 1, các mẫu hỗn hợp thu được (mẫu 5 - 7) giữ được đa số các thành phần hóa học của các tinh dầu đơn theo tỷ lệ tương ứng và không có sự hình thành các hợp chất mới. Điều này chứng tỏ, trong quá trình tạo hỗn hợp tinh dầu không xảy ra các tương tác hydro giữa các hợp chất hóa học trong tinh dầu đơn [16].
3.2. Khả năng kháng khuẩn
3.2.1. Tinh dầu đơn
Bảng 2 cho thấy, tinh dầu sả, chanh và quế có khả năng kháng chủng vi khuẩn S. aureus với đường kính vòng vô khuẩn phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu được sử dụng. Nhìn chung, khả năng kháng S. aureus của tinh dầu quế tốt hơn so với sả chanh, hơn gấp 2 lần ở nồng độ tinh dầu 10 và 20%; trong khi đó, tinh dầu cam và lài không kháng chủng vi khuẩn này (Hình 1). Nồng độ 40% tinh dầu sả, chanh trong nghiên cứu này đã thể hiện hoạt tính kháng S. aureus với đường kính vòng kháng 15 mm, trong khi với cùng đường kính trên, nghiên cứu của Mai et al. cần sử dụng đến 100% tinh dầu [9]. Tinh dầu quế có chứa 50% coumarin và cinnamaldehyde cùng với tinh dầu sả chanh có chứa gần 80% citral, các hoạt chất này được nhận định có khả năng xâm nhập vào lớp peptidoglycan và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gram dương [17].
Bên cạnh đó, khả năng kháng khuẩn của các tinh dầu được nghiên cứu sâu hơn thông qua các chỉ số IC50, MIC (Bảng 3). Chỉ với nồng độ 1,25% tinh dầu quế đã có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn, điều này cho thấy, nếu một số sản phẩm như nước hoa tinh dầu, băng gạt y tế, chất khử mùi, nước rửa tay,… có sử dụng tinh dầu thì chỉ cần một lượng rất nhỏ đã có thể hạn chế tối đa sự sinh trưởng và phát triển của S. Aureus. Tuy nhiên, mùi quế rất nồng, có tính nóng nên không được ưa chuộng nhiều, việc phát triển các sản phẩm từ quế cần được cải thiện bằng cách bổ sung thêm các loại tinh dầu khác có hương thơm dễ chịu hơn như sả chanh, lài, cam,... Do đó, nghiên cứu này khai thác khía cạnh về sự yêu thích mùi hương, sự dịu nhẹ khi sử dụng để tạo ra các loại hỗn hợp tinh dầu vừa phù hợp với nhu cầu của thị trường tiêu dùng hiện nay, vừa mang lại hiệu quả kháng khuẩn tốt.
3.2.2. Tinh dầu hỗn hợp
Từ 4 loại tinh dầu đơn lẻ, 3 mẫu hỗn hợp được nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và thu được kết quả như thể hiện trong Bảng 4 và 5. Kết quả Bảng 4 cho thấy, mẫu 5 (sả chanh/lài/quế với tỷ lệ 3/6/1) thể hiện kết quả kháng khuẩn tốt nhất, đường kính vòng kháng khuẩn xuất hiện ở nồng độ thấp nhất (10%) và tăng dần khi tăng nồng độ tinh dầu thử nghiệm; mẫu 6 và 7 cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn nhưng ở nồng độ cao hơn (từ 20% trở lên). Theo nguyên tắc “nốt hương” trong việc điều chế nước hoa [11], cả 3 hỗn hợp này đều có tiềm năng định hướng tạo ra 3 sản phẩm nước hoa tinh dầu - một trong những sản phẩm nước hoa thiên nhiên đang được sử dụng phổ biến. Bên cạnh đó, sả chanh, lài, cam hay quế đều là những loại thực vật nhiệt đới và được trồng nhiều tại khắp các tỉnh, thành phố của Việt Nam, sự phát triển của các sản phẩm nước hoa tinh dầu góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho các loại cây này.
Tương tự kết quả đường kính vòng kháng khuẩn, giá trị MIC và IC50 thể hiện ở Bảng 5 có giá trị thấp nhất (lần lượt là 2,5 và 1,25%) đối với mẫu 5; điều này cho thấy, chỉ cần 2,5% tinh dầu của Mẫu 5 đã có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Đặc biệt, mẫu 5 chỉ chứa rất ít tinh dầu quế (tương ứng 0,25%), 0,75% sả chanh và 1,5% tinh dầu lài đã mang lại hiệu quả kháng khuẩn. Trong khi đó, giá trị MIC của đơn tinh dầu sả chanh và quế lần lượt là 5% và 1,25%, tinh dầu cam không có khả năng kháng khuẩn. Điều này cho thấy, sự kết hợp của nhiều loại tinh dầu khác nhau làm tăng hiệu quả kháng khuẩn, có thể là do sự cộng hưởng giữa các loại tinh dầu, sự thay đổi một số nhóm chức làm tăng cường khả năng xâm nhập vào màng tế bào và ảnh hưởng đến sự tăng sinh tế bào [4].
3.3. Giá trị kinh tế của các sản phẩm nghiên cứu
Hiện nay, bên cạnh sự đa dạng về mùi hương và tính tự nhiên, yêu cầu giá thành sản phẩm cũng là một trong những chỉ tiêu lựa chọn đối với khách hàng. Giá thành của các tinh dầu nguyên chất thường cao, do đó, việc kết hợp các tinh dầu theo tỷ lệ khác nhau nhằm tiết kiệm tinh dầu được tính đến khi áp dụng trong các lĩnh vực khác nhau [7]. Theo kết quả kháng khuẩn, đơn tinh dầu sả chanh, quế và hỗn hợp tinh dầu (sả chanh/lài/quế) đều có khả năng ức chế sự tăng sinh của vi khuẩn S. aureus ở nồng độ rất thấp (1,5 - 5%) cho thấy tính kinh tế trong việc tạo các sản phẩm ứng dụng có chứa tinh dầu như nước hoa tinh dầu, băng gạc y tế...
Như đã trình bày ở mục 3.2, tinh dầu quế có mùi nồng và gây bỏng da nên hỗn hợp tinh dầu sả chanh/lài/quế (tỷ lệ 30/60/10) thu được có hương thơm dễ chịu do mùi hương nhẹ nhàng của hoa lài, tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của sả chanh và giảm độ nóng rát của quế. Bên cạnh đó, trên thị trường hiện nay giá thành của tinh dầu quế cao hơn so với sả chanh nên sự kết hợp của tinh dầu quế với các loại tinh dầu khác có giá thành thấp hơn sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành dược phẩm hay mỹ phẩm.
4. Kết luận
Nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu đơn (sả chanh, cam, lài, quế) và hỗn hợp của chúng bằng phương pháp GC/MS/MS. Kết quả thu được cho thấy, các hỗn hợp tinh dầu gần như giữ được các thành phần hóa học ban đầu của các tinh dầu đơn. Về khả năng kháng khuẩn, đơn tinh dầu quế thể hiện hoạt tính chống lại sự phát triển của chủng vi khuẩn S. aureus với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là 1,25%, tiếp đến là tinh dầu sả chanh có MIC = 5%. Tinh dầu cam và lài không kháng chủng vi khuẩn này. Trong các hỗn hợp tinh dầu, hỗn hợp sả chanh/lài/quế theo tỷ lệ 30/60/10 có khả năng kháng chủng S. aureus tốt nhất với MIC = 2,5%. Các mẫu hỗn hợp khác cũng thể hiện tính kháng khuẩn ở nồng độ cao hơn. Kết quả này cho thấy khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp tinh dầu và tiềm năng ứng dụng trong nhiều sản phẩm có chứa tinh dầu thiên nhiên.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được Trường Đại học Quốc tế Hồng Bàng cấp kinh phí thực hiện dưới mã số đề tài GVTC14.2.13.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1. Tracey A.T and Chandrashekhar G.U (2021). Staphylococcus aureus, StatPearls.
2. Jim O'Neill (2016). Review on antimicrobial resistance: tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations, Government of the United Kingdom.
3. Yannik K.S (2021). Bacterial Natural Product Drug Discovery for New Antibiotics: Strategies for Tackling the Problem of Antibiotic Resistance by Efficient Bioprospecting. Antibiotics, 10(7), 842.
4. Disha V., Shun-Kai Y., Chou M.C et al (2021). Essential oils as potential antimicrobial agents. Sustainable Agriculture Reviews 49: Springer, 93-122.
5. Đỗ Tất Lợi (2006). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
6. George D.M, Alexandru M.G, Cornelia B. et al (2017). Natural products used for food preservation. Food Preservation: Elsevier, 365-411.
7. Liêu Thùy Linh, Ngô Nguyễn Nhật Hà, Phan Thị Kim Liên và cộng sự (2017). Khảo sát ảnh hưởng của tinh dầu quế, sả chanh, húng quế, bạc hà và tác dụng kết hợp của chúng tới Saccharomyces cerevisiae và Asperigillus niger. Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường Đại học Công nghệ Thực phẩm TpHCM (1982-2017), 277-286.
8. Vũ Thu Trang, Nguyễn Thị Hoa (2015). Nghiên cứu hiệu quả kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus khi sử dụng kết hợp các loại tinh dầu Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 53(4), 417-417.
9. Nguyễn Thị Thanh Mai, Trần Bảo Trâm, Đỗ Thị Kim Trang và cộng sự (2020). Khảo sát hoạt tính sinh học và khả năng kháng khuẩn của tinh dầu sả chanh Cybopogon citratus trồng tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Báo cáo khoa học về Nghiên cứu và Giảng dạy Sinh học ở Việt Nam - Hội nghị khoa học quốc gia lần thứ 4, Đại học Quốc gia Hà Nội, 680-686.
10. Juan M.J.F, Omar G., Mónica A.R et al (2016). Chemistry and pharmacology of Citrus sinensis. Molecules, 21(2), 247.
11. Louis Hồ Tấn Tài (2003). Chất tẩy rửa và các sản phẩm chăm sóc cá nhân, Unilever.
12. Trương Minh Phụng, Lê Thị Thúy Hằng, Phạm Thị Hảo và cộng sự (2017). Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn nội sinh trong cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 20(5), 69-76.
13. Chairunnisaa, Hady A.T, Arde T.N (2017). Gas chromatography-Mass spectrometry analysis and antibacterial activity of Cinnamomum burmanii essential oil to Staphylococcus aureus and Escherichia coli by gaseous contact. AIP Conference Proceedings, 1823(1), 020073: AIP Publishing LLC.
14. Yanqun L., Dexin K., Xiaoman L. et al(2016). Quality evaluation for essential oil of Cinnamomum verum leaves at different growth stages based on GC-MS, FTIR and microscopy. Food analytical methods, 9(1), 202-212.
15. Wahyu A.W, Yulfi Z., Perry B. (2009). Minyak Atsiri dari Kulit Batang Cinnamomum burmannii (Kayu manis) dari Famili Lauraceae Sebagai Insektisida Alami, Antibakteri dan Antioksidan.
16. Dinesh K., Nitin M., Manish K.C et al (2017). In-vitro assessment of antimicrobial and antioxidant potential of essential oils from Lemongrass (Cymbopogon citratus), Cinnamon (Cinnamomum verum) and Clove (Syzygium aromaticum). Journal of Animal Research, 76(6),1099-1105.
17. Huỳnh Xuân Phong, Mai Kim Ngân, Trần Thị Thảo Nguyên và cộng sự (2021). Thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của tinh dầu vỏ bưởi Năm Roi (Citrus grandis (L.) Osbeck). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 57(Chuyên đề Công nghệ thực phẩm), 189-195.
Chemical composition and the anti-bacterial activities Staphylococcus aureus of some essential oils obtained from tropical plants
Nguyen Thi Thuy Hong1
Nguyen Tran Xuan Phuong1
Nguyen Le Vu2
Ho Thi Thach Thuy1
Do Chiem Tai1
1Hong Bang International University
2Ho Chi Minh City University of Medicine and Pharmacy
ABSTRACT:
In recent years, essential oils are studied and applied in many fields. In this study, the chemical composition and antibacterial activity of Staphylococcus aureus (S. aureus) of four essential oil singles including lemongrass, orange, jasmine, and cinnamon essential oils, and their mixtures are studied. The results show that the cinnamon oil and its mixture (lemongrass/jasmine/cinnamon = 30/60/10 (ratio % v/v)) have the best activity against S. Aureus. It proves the application potential of mixed essential oil and essential oil single in the pharmaceutical and cosmetic industries.
Keywords: essential oil, antibacterial activity, Staphylococcus aureus.
[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 12, tháng 5 năm 2022]
