TÓM TẮT:

Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của một số thông số công nghệ (tỉ lệ nguyên liệu:nước, tỷ lệ enzyme:cơ chất và thời gian ủ enzyme) đến hàm lượng saponin triterpenoid tổng và khả năng ức chế enzyme α-amylase của dịch thu được từ lá đinh lăng Polyscias Fruticosa (L.) Harms với sự hỗ trợ của enzyme cellulase đã được tiến hành. Kết quả cho thấy chế phẩm Viscozyme Cassava C. đã hỗ trợ hiệu quả cho quá trình trích ly. Điều kiện hoạt động phù hợp của enzyme này là pH môi trường 5; nhiệt độ xử lí mẫu 45^oC trong thời gian 40 phút với tỉ lệ enzyme:cơ chất 10µL/g nguyên liệu (1% v/w). Tại điều kiện này, hàm lượng saponin triterpenoide tổng và khả năng kháng enzyme α-amylase đạt lần lượt là 2,25±0,02 mg/g và 14,86±0,02 mg acarbose/g, lớn hơn xấp xỉ 1,75 lần so với các giá trị tương ứng của các mẫu cùng điều kiện không xử lý enzyme.

Từ khóa: Lá đinh lăng Polyscias Fruticosa (L.) Harms, saponin triterpenoid tổng, ức chế enzyme α-amylase, xử lý enzyme.

1. GIỚI THIỆU

Đinh lăng lá xẻ (Polyscias fruticosa (L.) Harms, Araliaceae) có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu cho thấy vỏ, rễ và lá đinh lăng chứa saponin, alcaloid, vitamin B1, B2, B6, vitamin C, acid amin, glycosid, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng và đường [1]. Ở Việt Nam, lá đinh lăng là dược liệu được sử dụng phổ biến trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh như viêm nhiễm, xơ vữa động mạch và đặc biệt là tiểu đường. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra lá đinh lăng có thể chứa đến 1,65% là các hợp chất saponin triterpenoid với thành phần chủ yếu là acid oleanolic [1].

Việc nghiên cứu về quá trình tách chiết các hợp chất sinh học nói chung và saponin triterpenoid từ thực vật hầu hết được tiến hành với sự hỗ trợ bằng dung môi. Song, cũng có một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng enzyme có thể hỗ trợ cho quá trình tách chiết các hợp chất bên trong tế bào. Joel Fleurence và cộng sự (1995) đã tiến hành phân cắt thành tế bào các loại tảo biển với sự hỗ trợ của nhóm enzyme (carrageenase, xylanase, P-agarase, cellulase). Cùng với sự tác động của enzyme, protein được giải phóng nhiều hơn ra khỏi tế bào [2]. Gần đây, nghiên cứu của Pujoyuwono Martosuyono và cộng sự (2015) cũng đã chỉ ra ảnh hưởng của các số yếu tố (nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ và thời gian) trong quy trình thủy phân thành tế bào rong biển khi sử dụng enzyme cellulase [3]. Rõ ràng, việc sử dụng enzyme cellulase trên một số đối tượng đã góp phần nâng cao hiệu quả tách chiết các hợp chất trong tế bào.

Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ của quá trình trích ly saponin triterpenoid từ lá đinh lăng với sự hỗ trợ của enzyme cellulase như tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, tỉ lệ enzyme:cơ chất, thời gian ủ. Đây chính là nghiên cứu tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về trích ly các hợp chất từ lá đinh lăng.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

Lá đinh lăng 1 - 2 năm tuổi tại xã Khánh Hưng, huyện Vĩnh Hưng, tỉnh Long An được loại bỏ cành và tạp chất, phơi khô, nghiền nhỏ và sàng qua rây 0,3mm. Phần qua rây có độ ẩm không quá 5% được đóng gói, bảo quản trong các túi zip để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo.

Chế phẩm enzyme cellulase có tên thương mại là Viscozyme Cassava C., được cung cấp bởi Công ty TNHH Brentag Việt Nam, có hoạt lực 100 FBG/g, điều kiện tối ưu pH 4,5 - 5,5, nhiệt độ 40 - 50^oC.

Các hóa chất phân tích khác đạt yêu cầu hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước

Nguyên liệu được cân chính xác 2 gram mẫu phối trộn với nước ở các tỉ lệ mẫu:nước khảo sát 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40 ngâm trong 1 giờ. Tiếp theo, hỗn hợp được ly tâm 5800 vòng/phút trong 15 phút, thu lấy dịch chiết để xác định hàm lượng saponin triterpenoid và khả năng kháng enzyme alpha - amylase.

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme: nguyên liệu

Hỗn hợp gồm bột đinh lăng và nước ở tỉ lệ phù hợp từ thí nghiệm 2.2.1 được tiến hành bổ sung enzyme với các tỉ lệ 0%, 0,5%, 1,0%, 1,5% và 2,0% (v/w) tại nhiệt độ 45^oC và pH 5, trong 1 giờ. Sau quá trình trích ly, hỗn hợp được ly tâm, thu lấy dịch để tiến hành xác định hàm lượng saponin triterpenoid và khả năng kháng enzyme alpha - amylase.

2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ

Từ tỉ lệ nguyên liệu:nước và tỉ lệ enzyme:nguyên liệu được chọn từ các thí nghiệm trên, hỗn hợp đinh lăng - nước được tiến hành trích ly với điều kiện nhiệt độ 45^oC, pH 5 và lấy mẫu ở các mốc thời gian 0, 20, 40, 60 và 80 phút. Các mẫu đối chứng không bổ sung enzyme cũng được tiến hành ở cùng điều kiện xử lý. Kế đến, hỗn hợp cũng được ly tâm để phân tích các chỉ tiêu.

2.3. Phương pháp phân tích

2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng saponin triterpenoide tổng

Hàm lượng saponin triterpenoide tổng được xác định như phương pháp của Gao với một số điều chỉnh: 0,2mL mẫu có nồng độ phù hợp được cho vào ống nghiệm cùng 0,2mL vanillin-acid acetic 5%, thêm 1,2mL acid perchloric, lắc đều, ủ ở 70^oC trong 15 phút rồi làm lạnh nhanh 2 phút, định mức tới vạch 5mL và đo quang ở bước sóng 548nm. Hàm lượng saponin triterpenoide tổng được tính theo đơn vị mg/g chất khô nguyên liệu, dựa trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn là acid oleanolic [4].

2.3.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α- amylase

Khả năng ức chế enzyme alpha amylase được tiến hành tương tự như trong nghiên cứu McCue và Shetty (2004): 1,6 ml mẫu đã pha loãng với đệm 6,9 có nồng độ phù hợp được cho vào ống nghiệm cùng 0,4 mL enzyme alpha - amylase 0,5 mg/mL và lắc đều, ủ ở nhiệt độ 37,5^oC trong thời gian 10 phút. Sau đó, ống nghiệm được bổ sung 0,5 ml dung dịch tinh bột và lắc đều, tiếp tục ủ ở nhiệt độ 37,5^oC trong thời gian 10 phút. Ống nghiệm được lấy ra và bổ sung 1,0 ml dung dịch 3,5-dinitrosalicylic acid rồi đun sôi ở 100^oC trong 5 phút. Tiếp đến, hỗ hợp được làm lạnh nhanh, pha loãng và so màu quang phổ với bước sóng 540 nm. Khả năng kháng enzyme α-amylase trong mẫu được tính tương đương với khả năng ức chế của chất chuẩn acarbose (mg acarbose/g) [5].

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Phân tích phương sai một nhân tố và kiểm định hậu tố LSD với mức ý nghĩa 5% được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức với sự hỗ trợ của phần mềm Statgraphics Centurion XVI.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước đến quá trình trích ly

Trong quá trình trích ly, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi ảnh hưởng quan trọng đến khả năng hòa tan của các hợp chất. Hình 1 thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước từ 1:10 đến 1:40 lên hàm lượng saponin triterpenoid tổng và khả năng ức chế enzyme alpha amylase của dịch chiết thu được từ lá đinh lăng. Khi tăng dần tỉ lệ nguyên liệu:nước, hàm lượng các chất chiết thu nhận được cũng ngày tăng lên. Cụ thể, tại nghiệm thức 1:30, hàm lượng saponin triterpenoid thu được đạt 1,32 ± 0,02 mg/g, cao gấp tỉ lệ 1:10 và 1:20 lần lượt 2,76 và 1,41 lần. Tuy nhiên, nếu tiếp tục gia tăng lượng nước, hàm lượng saponin triterpenoid lại có chiều hướng giảm. Quy luật tương tự cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của Jianmei Yu và cộng sự (2007) khi nghiên cứu về tác động của tỉ lệ nước/nguyên liệu lên khả năng thu nhận protein từ các chế phẩm protein đậu nành [6].

anh-huong-cua-ti-le-nguyen-lieu.nuoc-den-qua-trinh-trich-ly

Ngoài ra, quy luật ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:nước lên khả năng kháng enzyme α-amylase cũng tương đồng với hàm lượng saponin triterpenoid tổng. Điều này có thể là thành phần saponin triterpenoid là thành phần chủ yếu có trong dịch trích từ lá đinh lăng có hoạt tính sinh học này. Khả năng ức chế enzyme α- amylase đạt cực đại tại nghiệm thức tỉ lệ nguyên liệu nước 1:30.

3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme cellulase:nguyên liệu đến quá trình trích ly

Hàm lượng saponin triterpenoid tổng và khả năng ức chế enzyme α- amylase tăng dần và đạt cực đại tại tỉ lệ enzyme:cơ chất là 1,0% (Hình 2). Lúc này, hàm lượng saponin triterpenoid tổng và khả năng ức chế enzyme amylase lần lượt cao gấp 1,52 lần và 1,49 lần so với mẫu đối chứng không xử lý enzyme. Rõ ràng quá trình xử lý enzyme đã góp phần phân cắt thành tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho chất chiết dễ dàng đi vào dung dịch [3]. Tuy nhiên, nếu tiếp tục gia tăng tỉ lệ enzyme từ 1,0% lên 2,0%, kết quả về hàm lượng và khả năng ức chế lại giảm. Thông thường, khi càng tăng lượng enzyme xử lý, hàm lượng các chất chiết thu được sẽ dần tiến đến trạng thái cân bằng. Tuy nhiên, sự khác biệt của kết quả thu được có thể là do sự ức chế cạnh tranh của các gốc đường của phân tử saponin làm giảm hiệu quả của việc phân cắt thành tế bào của chế phẩm enzyme; đồng thời việc phân cắt làm giảm hàm lượng và hoạt tính của các hợp chất saponin.

3.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ enzyme

Khi thời gian ủ enzyme tăng dần thì hiệu quả trích ly cao nhất tại mức 40 phút. Tại nghiệm thức này, hàm lượng saponin triterpenoid tổng đạt 2,25±0,02 mg/g và khả năng kháng enzyme α-amylase tương đương với 14,86±0,02 mg acarbose/g. Thời gian ủ enzyme càng dài thì 2 đại lượng này có dấu hiệu giảm nhẹ. Hơn nữa, khi xét cùng một điều kiện, các mẫu có xử lý enzyme luôn cho giá trị về hàm lượng và khả năng ức chế cao hơn hẳn so với mẫu không xử lý enzyme gấp trung bình 1,65 lần cho cả hai hàm mục tiêu. (Hình 3)

Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến quá trình trích ly

4. KẾT LUẬN

3 yếu tố công nghệ cơ bản gồm tỉ lệ nguyên liệu:nước, tỉ lệ enzyme:cơ chất và thời gian xử lý enzyme đã được khảo sát để đánh giá sự ảnh hưởng của chúng đến quá trình trích ly saponin triterpenoid và hoạt tính kháng enzyme α-amylase. Cả 3 đều có chung quy luật tác động đó là các giá trị hàm mục tiêu đều tăng lên một mức nào đó rồi giảm xuống.

Khi xét cùng một điều kiện, các các mẫu có xử lý enzyme đều cho hiệu quả cao hơn so với các mẫu không xử lý. Các thông số phù hợp cho quá trình trích ly saponin triterpenoid và khả năng ức chế enzyme α-amylase từ lá đinh lăng là tỉ lệ nguyên liệu:nước là 1:30, tỉ lệ enzyme: cơ chất là 1%, thời gian xử lý là 40 phút. Rõ ràng, kỹ thuật siêu âm đã góp phần hiệu quả vào quá trình trích ly các hợp chất từ lá đinh lăng.

LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu này do Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm

Thành phố Hồ Chí Minh bảo trợ và cấp kinh phí theo

Hợp đồng số 89/HĐ-DCT.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Ngô Ứng Long, Cây Đinh lăng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 1986.
Joel Fleurence, Laurence Massinani, Odile Guyader và Serge Mabeau, Use of enzymatic cell wall degradation for improvement of protein extraction from Chondrus crispus, Gracilaria verrucosa and Palmaria palmata, Journal of Applied Phycology, 7, pp. 393 - 397, 1995.
Pujoyuwono Martosuyono, Andi Hakim, Yusro Nuri Fawzya, Chemical pretreatment and enzymatic saccharification of seaweed solid wastes, Squalen Bulletin of Marine & Fisheries Postharvest & Biotechnology, vol. 10(2), pp. 61 - 71, 2015.
Gao Shanlin, Wang Hong, Technique on Extraction and content determination of saponin from Momordica Grosvenori, Natural Product Rearch and Developmen, vol. 13(2), pp. 36-40, 2001.
Patrick P McCue, Kalidas Shetty, Inhibitory effects of rosmarinic acid extracts on porcine pancreatic amylase in vitro, Asia Pac J Clin Nutr, vol. 13(1), pp. 101-106, 2004.
Jianmei Yu, Mohamed Ahmedna, Ipek Goktepe, Peanut protein concentrate: Production and functional properties as affected by processing, Food Chemistry, vol. 103, pp. 121-129, 2007.

CELLULASE – ASSISTED EXTRACTION OF THE TOTAL TRITERPENOID SAPONINS FROM POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARMS LEAVES

MA. NGUYEN THI NGOC THUY - NGUYEN NGOC YEN DIEU -TA THI MY DUNG - TRAN HOAI HAU – MA. TRAN CHI HAI

Faculty of Food Technology

Ho Chi Minh City University of Food Industry

ABSTRACT:

In this study, the influence of extraction conditions (i.e., the ratio of raw material per water, the ratio of enzyme per substrate, and the enzyme incubation time) on the total triterpenoid saponins content and the α-amylase inhibition of the extract obtained from Polyscias Fruticosa (L.) Harms leaves with enzyme cellulase support was tested. The results showed that Viscozyme Cassava C. effectively assisted the extraction process. The optimum extraction conditions for this enzyme were the environmental pH of 5, the treatment temparature of 45^oC, the treatment time of 40 minutes, and the ratio of enzyme per substrate of 10µL/g raw material (1% v/w). At these conditions, the total triterpenoid saponins content and the α-amylase inhibition reached 2.25±0.02 mg/g and 14.86± 0.02 mg acarbose/g, respectively. These figures were greater than approximately 1.75 times compared to the samples without enzyme treatment in the same conditions.

Keywords: Polyscias Fruticosa (L.) Harms leaves, the total triterpenoid saponins content, the α-amylase inhibition, enzyme treatment.