Nghiên cứu điều kiện trích ly protein từ rong lục chaetomorpha sp. ở vùng biển Giao Thủy, tỉnh Nam Định

TÓM TẮT:

Hiện nay, việc nghiên cứu và phát triển các quy trình thu nhận protein từ các nguồn nguyên liệu khác nhau đang được chú trọng và đã đem lại nhiều lợi ích. Rong lục Chaetomorpha sp. là một trong những loại nguyên liệu tiềm năng có nguồn protein, đường tổng số và cellulose cao, nhưng đang bị loại bỏ một cách lãng phí. Trong nghiên cứu này, sự phá vỡ tế bào bằng enzyme và dung môi kiềm cũng được chỉ ra. Và để nâng cao hiệu suất, trong nghiên cứu này đã xác định các thông số tối ưu thu nhận protein hòa tan trong nước là 26,73mg/g nguyên liệu với điều kiện nồng độ enzyme Celluclast 1,5L 1%, nhiệt độ 50⁰C, thời gian 60 phút và thu nhận protein hòa tan trong kiềm ở nồng độ dung môi NaOH là 1%, thời gian trích ly 2 giờ, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 1:30 là 35, 29mg/g nguyên liệu. Những phát hiện này rất hữu ích cho việc phát triển phụ gia thức ăn mới trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm.

Từ khóa: Chaetomorpha sp., rong lục, trích ly protein, thủy phân thành tế bào.

1. Đặt vấn đề

Rong lục Chaetomorpha sp. thuộc ngành Chlorohyta, họ rong mền hay rong lông Cladopharaeae, sợi rong dài từ 2-4m phát triển thành đám mọc tự nhiên ở các thủy vực nước mặn, lợ trên khắp thế giới [3, 10]. Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng, rong biển chứa nhiều nguồn dinh dưỡng có lợi như carbohydrate, protein, các khoáng chất và vitamin. Protein trong rong biển được xem là chứa các thành phần acid amin tương đối phù hợp cho sử dụng làm thức ăn cho con người hay trong chăn nuôi [9]. Hàm lượng protein trong rong biển có sự khác nhau tùy theo loài, ánh sáng, độ mặn và địa lý [6,15]. Các tác nhân thường sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein chủ yếu là dựa vào sự thay đổi nhiệt độ, nồng độ proton (pH) và sử dụng các dung môi hóa học [14]. Tuy nhiên, việc trích ly protein bị hạn chế bởi thành phần tế bào như alginates trong Phaeophyta hoặc các carrageenans trong Rhodophyta. Để nâng cao hiệu suất thì nghiền cơ học, xử lý siêu âm hay enzyme cellulase cũng được sử dụng để cắt đứt các liên kết của thành tế bào và giải phóng protein [1, 17]. Để phù hợp với nguồn nguyên liệu, điều kiện sản xuất, vẫn cần nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein sao cho giảm được lượng dung môi sử dụng thân thiện với môi trường mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học của protein. Chính vì vậy, mục tiêu của bài báo là nghiên cứu thu nhận protein từ sinh khối rong lục nước lợ Chaetomorpha sp. mọc tự nhiên gây ô nhiễm môi trường ở huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định với chiều dài bờ biển lên đến 32km, có diện tích nuôi trồng thủy sản lớn và vườn quốc gia ngập mặn Xuân Thủy. Kết quả của bài báo là khảo sát các điều kiện để thu nhận thành phần protein có giá trị của rong lục từ nguồn sinh khối hiện dư thừa và gây ô nhiễm môi trường. Đây là cơ sở để tiến hành khai thác phế phụ phẩm đem lại giá trị kinh tế và tính thực tiễn cao.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên liệu

Rong lục Chaetomorpha sp. được thu nhận sau 20-25 ngày phát triển tại huyện Giao Thủy tỉnh Nam Định từ tháng 7- tháng 8 năm 2022. Rong tươi sau khi thu hoạch được ngâm, khuấy trộn trong nước ngọt 60 phút để làm sạch và rửa mặn. Sau đó tiến hành sấy ở 60⁰C đến độ ẩm 5-10%, rồi tiến hành nghiền nhỏ tạo điều kiện cho quá trình trich ly.

- Chế phẩm enzyme Visocozyme L (Novozymes, Đan Mạch) được thu nhận từ Aspergillus aculeatus. Hoạt tính 100FBG/g (FBG-Fungal Beta - Glucanase Units), pH 3,3-5,5, nhiệt độ 25-55⁰

- Chế phẩm enzyme Celluclast 1,5L (Novozymes, Đan Mạch) được thu nhận từ Trichoderma reesi. Hoạt tính 100FBG/g (FBG-Fungal Beta - Glucanase Units), pH 3,3-5.5, nhiệt độ 25-60⁰

2.2. Các phương pháp phân tích

Hàm lượng protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet.

Hàm lượng protein hòa tan được xác định theo phương pháp Lowry trên máy đo quang phổ UV-Vis.

Các chỉ tiêu đường tổng, tinh bột, cellulose, hàm lượng tro và ẩm được xác định theo các phương pháp của FAO và AOAC.

Phân tích tro theo TCVN 9742:2013. pH môi trường được đo bằng pH kế HANA, độ mặn được xác định bằng khúc xạ kế Atago.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Quy trình trích ly protein từ sinh khối rong lục

Quy trình được sử dụng để trích ly protein hòa tan trong nước và dung môi kiềm từ sinh khối rong lục đã sấy khô dựa trên các phương pháp được mô tả bởi Fleurence, Le Coeur et al. (1995) [5] cụ thể như sau: Rong tươi à Ngâm, rửa mặn và làm sạch àSấy khô à Nghiền xay nhỏ à Xử lý bằng enzyme Cellulose thu protein hòa tan trong nước (Ly tâm thu dịch àXác định protein hòa tan trong nước) à Bã à Xử lý kiềm à Dịch trích ly protein hòa tan trong kiềm à Ly tâm thu dịch à Xác đinh hàm lượng protein.

2.3.2. Nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp cho hỗ trợ trích ly protein hòa tan trong nước

Cân 10g nguyên liệu sấy khô, nghiền min và rây bằng sàng có kích thước 0,1mm. Sau đó tiến hành ngâm với 200ml dung dịch đệm citrate 0,1M pH 5,0 ở nhiệt độ 50⁰C trong thời gian 60 phút và nồng độ enzyme 0,25% (hai chế phẩm enzyme Visocozyme L, Celluclast 1,5L). Hỗn hợp được khuấy 120 vòng/phút cho đồng nhất và tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu với enzyme. Sau khi thủy phân tiến hành ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ thường 15 phút để thu dịch protein hòa tan trong nước.

2.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của enzyme đến quá trình trích ly protein hòa tan trong nước

Thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein với sự thay đổi nồng độ enzyme (0,25; 0,5; 1,0; 1,5%); thời gian thủy phân (30, 60, 90, 120) phút và nhiệt độ 30⁰C, 40⁰C, 50⁰C, 60⁰C được bố trí như Bảng 1.

Bảng 1. Bố trí TN khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng thu nhận protein hòa tan trong nước

Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút và thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan.

2.3.4. Khảo sát các điều kiện đến quá trình trích ly protein hòa tan trong kiềm

Phần bã rắn còn lại sau khi tách protein tan trong nước sẽ được tiếp tục sử dụng để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein tan trong dung môi kiềm với nồng độ NaOH 0,5%, 1%, 1,5%, 2.0% w/v, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, thời gian 1, 2, 3, 4 giờ ở nhiệt độ 50⁰C được bố trí như Bảng 2.

Bảng 2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein tan trong dung môi kiềm

Sau khi trích ly, ly tâm thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan.

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Kết quả được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) với mức ý nghĩa p = 0,05 bằng phần mềm SPSS.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Thành phần hóa học của rong lục Chaetomorpha sp. ở vùng biển Giao Thủy

Các chỉ tiêu phân tích gồm hàm lượng protein, lipid, tro, đường tổng số, độ tro của mẫu rong thu được tại vùng nước lợ huyện Giao Thủy được tính theo % trọng lượng khô được thể hiện ở Hình 1.

Hình 1: Hàm lượng các thành phần hóa học

tính theo % trọng lượng khô

Theo số liệu ở Bảng 1, nhận thấy hàm lượng protein thu nhận ở rong biển Chaetomorpha sp. vùng biển Giao Thủy khá cao 18,35% so với hàm lượng protein của rong Chaetomorpha linum ở vùng biển Khánh Hòa, Nha Trang 14,14% của tác giả Võ Thành Trung, 2015 và hàm lượng này cũng nằm trong khoảng trung bình của một số loài rong lục khác như Ulva, Cladophora và Enteromorpha đã được nghiên cứu về thành phần sinh hóa của rong biển nhiệt đới của nhiều tác giả như Barbarino và Lourenço, 2005 và Neveux, 2015 [2,8,16]. Ngoài ra, các chỉ tiêu khác cũng được phân tích cho thấy rong lục Chaetomophar sp. này cũng rất tiềm năng khi hàm lượng đường tổng số và cellulose cao sẽ là nguyên liệu cho quá trình lên men ethanol [16].

Hàm lượng các thành phần hóa học của rong biển phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện môi trường sống, sự khác biệt được nhận thấy trong cùng một loài ở các nghiên cứu thuộc các vùng địa lý khác nhau hoặc giữa các loài rong cùng 1 vùng địa lý [11,12]. Vùng biển huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định - khu vực nghiên cứu là vùng có sự giao thoa môi trường sông (Ninh Cơ) - biển, đây là một trong những yếu tố sẽ tác động đặc trưng lên hệ rong biển của vùng. Trong quá trình thu nhận nguyên liệu, chúng tôi cũng ghi nhận được sự thích nghi khá cao của loài rong lục Chaetomorpha sp. ở huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định với môi trường nước có pH từ 7-8, độ mặn trung bình trong khoảng 20-25ppt và nền đáy chủ yếu là nền cát, cát - bùn.

3.2. Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme thích hợp cho trích ly cho protein hòa tan trong nước

Nhìn chung, các enzyme cellulase thương mại phổ biến trên thị trường phân hủy thành tế bào hiện nay là chế phẩm Visocozyme L và Celluclast 1,5L giúp thủy phân cellulose, hemicellulose… tạo điều kiện giải phóng protein. Để lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình trích ly protein từ rong lục ở huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định. Thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.2. Kết quả thu được như Hình 2.

Hình 2: Nghiên cứu lựa chọn enzyme thích hợp cho trích ly protein

Kết quả Hình 2 cho thấy chế phẩm Celluclast 1,5 L cho hiệu quả thu nhận protein hòa tan trong nước (25,76%) cao hơn so với chế phẩm Visocozyme L. Nhờ có enzyme hỗ trợ đã tăng hiệu quả trích ly protein lên hơn 40% so mẫu ban đầu. Kết quả này cũng tương đồng với Fleurence và cộng sự (1995) khi so sánh các quy trình trích ly protein từ rong biển Ulva Rigida và Ulva rotundata bằng các phương pháp cổ điển và enzyme [5]. Chính vì vây, chúng tôi lựa chọn chế phẩm enzyme Celluclast 1,5 L để tiếp tục nghiên cứu.

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein hòa tan trong nước

Trong các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein có sự hỗ trợ của enzyme, chúng tôi giữ nguyên tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất: dung dịch đệm sodium citratre 1:20, chọn pH=5 (theo khuyến cáo nhà sản xuất chế phẩm enzyme), vì theo các kết quả khảo sát thì protein của rong Chaetomorpha sp. chủ yếu là 2 nhóm có khả năng tan trong nước và tan trong kiềm có pI đẳng điện nằm trong khoảng pH 3-4 [5, 7].

Tiến hành tối ưu các điều kiện ảnh hưởng bằng khảo sát đa biến như mục 2.3.3. Kết quả thu được xử lý bằng phân tích anova với mức ý nghĩa p = 0,05 thể hiện trong Hình 3.

Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian đến hiệu quả thu nhận protein hòa tan trong nước

Qua Hình 3 nhận thấy ở nồng độ enzyme Cellulast 1,5L 1%, nhiệt độ 50⁰C, thời gian thủy phân 60 phút cho hàm lượng thu nhận protein hòa tan trong nước cao từ 25,68 - 26,83 mg/g nguyên liệu. So sánh kết quả này với nghiên cứu của tác giả Bạch Ngọc Minh và cộng sự (2015) khi trích ly với rong mềm Chaetomorpha sp. được thu nhận tại các ao nuôi tôm quảng canh tại huyện Giá Rai, tỉnh Bạc Liêu với enzyme sử dụng là chế phẩm enzyme cellulase của hãng Genecor ở điều kiện các thông số tối ưu là nồng độ enzyme 121UI/g cơ chất, thời gian 90 phút, nhiệt độ 40⁰C thì hàm lượng protein thu được cao hơn là 38,921 mg/g cơ chất [1,7]. Sự chênh lệch không đáng kể này được lý giải do khác nhau về đặc điểm thành phần hóa học trong rong lục tại huyện Giao Thủy và quá trình xử lý nguyên liệu.

3.4. Nghiên cứu các điều kiện trích ly protein hòa tan trong kiềm

Theo các báo cáo của E. Deniaud và cộng sự (2003) cho thấy một lượng đáng kể protein được tìm thấy liên kết với các thành phần phi protein khác như polysacarit và polyphenol trong thành tế bào và cũng chỉ ra để tăng hiệu quả trích ly protein không hòa tan trong nước cao bằng dung dịch kiềm (NaOH) [4]. Bên cạnh đó, dung dịch NaOH thường được sử dụng trong việc chiết xuất các thành phần giàu protein từ các nguồn thực vật và động vật.

Trong nghiên cứu này, tiến hành tối ưu đa biến với một số điều kiện ảnh hưởng đến chiết xuất như nồng độ kiềm (NaOH), thời gian và tỷ lệ nguyên liệu : dung môi đã được đánh giá để xác định ảnh hưởng của chúng đối với việc thu nhận protein.

Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu : dung môi đến hiệu quả thu nhận protein hòa tan trong kiềm

Kết quả Hình 4 cho thấy, khi nồng độ dung dịch kiềm tăng từ 0,5-1%, hàm lượng cũng tăng tuy nhiên khi tăng trên 1% thì giảm do biến tính protein và hạn chế khả năng hòa tan. Chính vì vậy, khi tiến hành khảo sát đa biến thay cho đơn yếu tố của các nghiên cứu trước đây sẽ xác định điều kiện thích hợp mà không cần tiếp tục thực nghiệm tối ưu và ở nồng độ dung môi NaOH là 1%, thời gian trích ly 2 giờ, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 1:30 hàm lượng thu nhận protein cao nhất trong khoảng 34,72 - 35,86 mg/g nguyên liệu. Hàm lượng thu nhận protein này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả Kumar và cộng sự (2010) khảo sát trên 18 loài rong biển khác nhau thuộc 3 ngành Chlorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta tại Ấn Độ cho thấy hàm lượng protein thay đổi từ 10 - 35 mg/g nguyên liệu [6].

Để đánh giá hiệu quả trích ly protein hòa tan trong nước và trong kiềm, chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở điều kiện tối ưu là nồng độ enzyme Cellulast 1,5L 1%, nhiệt độ 50⁰C, thời gian thủy phân 60 phút và nồng độ dung môi NaOH là 1%, thời gian trích ly 2 giờ, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 1:30 thì hàm lượng protein thu được lần lượt 26,73mg/g, 35, 29mg/g nguyên liệu. Kết quả này cho thấy hàm lượng protein thu nhận từ rong lục Chaetomorpha sp. vùng Giao Thủy khá cao và rất tiềm năng [14]. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất cần có các biện pháp hỗ trợ phá vỡ thành tế bào như kết hợp nghiền cơ học với phương pháp siêu âm cũng như các điều kiện hạn chế biến tính protein và phương pháp tinh sạch protein phù hợp.

4. Kết luận

Việc khai thác tài nguyên thiên nhiên để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học ngày càng được quan tâm. Protein từ rong biển là nguyên liệu tiềm năng đáng kể cho ngành công nghiệp thực phẩm cũng như thức ăn chăn nuôi trong tương lai. Nghiên cứu này đã xác định được các thông số quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận protein từ rong lục Chaetomorpha sp. vùng Giao Thủy, đặc biệt quá trình thủy phân nhờ enzyme với điều kiện nồng độ enzyme Celluclast 1,5L 1%, nhiệt độ 50⁰C, thời gian 60 phút và thu nhận protein hòa tan trong kiềm ở nồng độ dung môi NaOH là 1%, thời gian trích ly 2 giờ, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 1:30 thì protein tổng là 62,02 mg/g nguyên liệu. Bên cạnh đó, cũng chỉ ra phương pháp gián đoạn này có thể không khả thi cho quy mô công nghiệp. Vì vậy, cần có các nghiên cứu tiếp theo để tối ưu phương pháp trích ly cùng một quy trình cho protein hòa tan trong kiểm với nồng độ enzyme giảm hay không.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Bạch Ngọc Minh, Huỳnh Hoàn Mỹ, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, (2019). Tối ưu hóa quá trình trích ly protein từ sinh khối Chaetomorpha sp. bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ - Khoa học tự nhiên, 3(3), 136-143.
Barbarino, E. and S.O. Lourenço, (2005). An evaluation of methods for extraction and quantification of protein from marine macro-and microalgae. Journal of Applied Phycology, 17(5), 447-460.
Dodds, W.K. and Gudder, D.A., (1992). The ecology of Cladophora. Journal of Phycology 28(4): 415- 427.
Deniaud, J. Fleurence, M. Lahaye, Preparation and chemical characterization of cell wall fractions enriched in structural proteins from Palmaria palmata (Rhodophyta), Botanica Marina, 46 (2003), 366-377.
Fleurence, C. Le Coeur, S. Mabeau, M. Maurice, A. Landrein, (1995). Comparison of different extractive procedures for proteins from the edible seaweeds Ulva rigida and Ulva rotundata, Journal of Applied Phycology, 7 (6), 577-582.
Kumar, J., et al., (2010). Variation of biochemical composition of eighteen marine macroalgae collected from Okha coast, Gulf of Kutch, India. Electronic Journal of Environmental, Agricultural & Food Chemistry, 9(2).
Minh BN, Mỹ HH, Anh HK, Ánh L, Sương NK (2015). Ảnh hưởng của dạng nguyên liệu và quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất tách protein từ rong lục Chaetomorpha sp. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 13(4A):1335-
Neveux, N., et al., (2015). Comparing the potential production and value of high‐energy liquid fuels and protein from marine and freshwater macroalgae. Gcb Bioenergy, 7(4): p. 673-689.
Nguyễn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thiện Toàn và Trần Ngọc Hải, 2014a. Khả năng sử dụng rong bún (Enteromorphasp.) và rong xanh (Cladophoraceae) khô làm thức ăn cho cá tai tượng (Osphronemus goramy). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 35:104-110.
Nguyễn Văn Tiến, 2007. Thực vật chí Việt Nam 10. Ngành rong lục (Chlorophyta pascher). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Nielsen, M. M., D. Manns, M. D'Este, D. Krause-Jensen, M. B. Rasmussen, M. M. Larsen, M. Alvarado-Morales, I. Angelidaki and A. Bruhn (2016). "Variation in biochemicalcomposition of Saccharina latissima and Laminaria digitata along an estuarine salinity gradient in inner Danish waters", Algal Research, 13, 235-245.
Parthiban, C., C. Saranya, K. Girija, H. A., S. M. and A. P (2013). “Biochemical composition of some selected seaweeds from Tuticorin coast", Advances in Applied Science Research, 4(3), 362-366.
Phạm Hoàng Hộ, (1969). Rong biển Việt Nam. NXB Giáo dục Việt Nam.
Ranjan, S., et al., (2012). Comparative Evaluation of protein extraction methods from few leguminous seeds. Int J Adv Biotechnol Res, 3, 558Ā563.
Rosni, S.M., et al., (2015). Crude proteins, total soluble proteins, total phenolic contents and SDS-PAGE profile of fifteen varieties of seaweed from Semporna, Sabah, Malaysia. International Food Research Journal, 22(4),
Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2015). Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lục Chaetomorpha linum bằng enzyme và ứng dụng trong sản xuất bioethanol, 201-206.
Joubert, J. Fleurence, (2008). Simultaneous extraction of protein and DNA by an enzymatic treatment of the cell wall of Palmaria palmata (Rhodophyta) Journal of Applied Phycology, 20, 55-61.

A study on the conditions for the extraction process of protein from green seaweed Chaetomorpha sp. grown in Giao Thuy coast, Nam Dinh province

Ph.D Pham Thi Thu Hoai

University of Economics – Technology for Industries

Abstract:

The development of processes for obtaining protein from different raw materials are receiving great attention and these processes have brought many benefits. Green seaweed Chaetomorpha sp. is a good source of protein, total sugar and cellulose but it is wastefully discarded. Cellular breakthrough by enzymes and alkaline solvents is also examined in this study. The optimal parameters for obtaining water-soluble protein are 26.73mg/g of raw material with these following conditions: the Celluclast concentration of 1.5L 1%, the temperature at 50⁰C, and the hydrolysis time of 60 minutes, and the collected protein is dissolved in NaOH 1% with the extraction time of 2 hours and the ratio of raw to solution 1:30. These findings are useful for the development of new feed additive in the food industry.

Key words: Chaetomorpha sp., green seaweed, protein extraction, cell wall hydrolysis.