Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp indole-3-acetic acid từ chủng Bacillus subtilis CG2

TÓM TẮT:

Nghiên cứu này nhằm phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử cũng như khả năng sinh tổng hợp IAA từ các mẫu đất thu thập tại Việt Nam để ứng dụng trong việc cải tạo đất. Kết quả thu được 5 dòng vi khuẩn, trong đó dòng CG2 cho thấy hiệu quả cao nhất. Dòng CG2 được xác định là Bacillus subtilis dựa trên trình tự 16S rRNA. Các đơn yếu tố chính ảnh hưởng đến năng suất sinh tổng hợp IAA được xác định và sau đó phân tích mối tương quan bằng phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng thiết kế Box-Behnken. Lượng IAA cao nhất là 52,77 ± 0,38 µg/mL đạt được trong điều kiện: sucrose (X₁) = 1,096%; (NH₄)₂SO₄ (X₂) = 0,0498%; tryptophan (X₃) = 0,0103%. Như vậy, Bacillus subtilis CG2 cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp để nâng cao năng suất cây trồng.

Từ khóa: Indol-3-acetic, vi khuẩn, tối ưu, Bacillus subtilis, cải tạo đất, nông nghiệp.

1. Đặt vấn đề

Tại Viêt Nam, tình trạng suy thoái và kiệt quệ chất dinh dưỡng trong đất đã và đang được quan tâm rộng rãi [1]. Đây là lý do chính dẫn đến sự suy giảm năng suất và nguyên nhân được cho là do sử dụng phân bón hóa học không đúng cách dẫn đến mất đa dạng sinh học và suy thoái đất. Trong nông nghiệp, việc sử dụng phân bón là quan trọng để đảm bảo năng suất mùa vụ vì chúng cung cấp các chất dinh dưỡng quan trọng cho cây [1]. Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón hóa học quá mức và không có sự kiểm soát dẫn đến những tác động đối với môi trường cũng như các mối nguy hại đối với sức khỏe con người. Trước tình hình đó, việc quan trọng và cấp thiết là phải tìm ra các biện pháp thay thế để vừa đảm bảo năng suất cạnh tranh, trong khi vẫn đảm bảo được độ phì nhiêu của đất. Việc sử dụng các sản phẩm khác thay thế cho phân bón hóa học đang được xem là giải pháp tiềm năng [2, 3].

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn đóng vai trò thiết yếu đối với độ phì nhiêu của đất nhờ khả năng cải tạo đất bằng cách sinh các enzyme ngoại bào, chất kích thích sinh trưởng, khả năng hòa tan lân, kali và khoáng chất trong đất. Trong đó, vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật được coi là ứng cử viên triển vọng nhất vì có khả năng thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật [4]. Indole-3-acetic acid (IAA) đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển tế bào và khởi đầu quá trình phân chia tế bào rễ [2]. Nhiều dòng vi khuẩn thúc đẩy sinh trưởng thực vật đã được công bố, chủ yếu từ các chi Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia và Enterobacter [5-8]. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu đối với vi khuẩn bản địa để ứng dụng trong nông nghiệp tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu hiện tại nhằm mục đích phân lập dòng vi khuẩn bản địa ở Việt Nam có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp nhờ khả năng hình thành bào tử và kích thích sinh trưởng thực vật. Việc tối ưu hóa sản xuất IAA cũng được thực hiện đối với chủng vi khuẩn được chọn lọc để tăng cường hiệu quả sử dụng.

2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu và môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Mẫu đất được thu nhận tại rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam (toạ độ 10°29'33"N, 106°47'47"E). Các mẫu đất được thu thập vào tháng 6/2024, được lưu trữ trong túi nhựa Zip-lock và vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích trong ngày.

Môi trường Tryptose Soybean broth (TSB) dùng để nuôi cấy vi khuẩn gồm 17 g tryptone, 3 g papaic digest soybean meal, 2,5 g glucose, 2,5 g dipotassium phosphate và 5 g sodium chloride hòa tan đều trong 1 L nước cất. Môi trường Tryptose Soybean Agar (TSA) dùng để phân lập vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách bổ sung 1.5% agar vào môi trường TSB. Tất cả các môi trường được khử trùng 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập vi khuẩn

Mẫu đất được tiến hành pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ pha loãng 10^-5. Để phân lập các chủng vi khuẩn hình thành nội bào tử, dịch pha loãng được xử lý ở 80°C trong 10 phút. Sau đó, 100 µL dịch pha loãng ở nồng độ 10^-3 và 10^-5 được sử dụng để cấy trải trên môi trường thạch TSA. Sau 1 ngày nuôi cấy ở 30°C, các khuẩn lạc khác nhau về mặt hình thái được chọn, làm thuần và bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 4°C. Các chủng này được sử dụng để đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA.

2.2.2. Xác định hàm lượng IAA

Hàm lượng IAA được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski. Sinh khối vi khuẩn được nuôi trong ống nghiệm ở 30°C có lắc 180 vòng/phút trong 7 ngày, được đem đi ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để thu dịch nổi. 1 mL phần dịch được trộn với 2 mL thuốc thử Salkowski và ủ tối trong 30 phút, sau đó đem đi xác định mật độ quang ở bước sóng 530 nm. Hàm lượng IAA được xác định dựa vào đường chuẩn. Tất cả nghiệm thức được thực hiện lặp lại ba lần. Sự khác biệt giữa các nhóm được kiểm tra bằng ANOVA. Giá trị p <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

2.2.3. Định danh dòng vi khuẩn có khả năng sinh IAA cao nhất

Để định danh vi khuẩn ở mức độ loài, các phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại trình tự gen mã hóa 16S rRNA bằng PCR và giải trình tự được tiến hành theo phương pháp đã được mô tả bởi Nguyen và cộng sự [9, 10]. Trình tự 16S rRNA của dòng vi khẩn phân lập được sử dụng để so sánh với trình tự tham chiếu từ cơ sở dữ liệu 16S ribosomal RNA NCBI genbank bằng phương pháp BlastN.

2.2.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và tryptophan đối với quá trình sản sinh IAA

Để đánh giá tác động của nguồn cacbon và nitơ đối với quá trình sản sinh IAA, quá trình nuôi cấy được tiến hành trong các ống nghiệm chứa 5 mL môi trường TSB. Môi trường tiền nuôi cấy vi khuẩn (5%, v/v) sau đó được đưa vào các ống nghiệm có 5 mL môi trường TSB bổ sung các nguồn cacbon khác nhau (glucose, fructose, mannitol, mật rỉ đường, tinh bột hoặc sucrose) ở nồng độ 10 g/L với sự có mặt 0,1 g/L tryptophan. Nguồn cacbon tối ưu được xác định theo lượng IAA sản sinh. Sau đó, dựa trên nguồn cacbon tốt nhất, 6 nồng độ 1; 5; 10; 15; 30 và 50 g/L được thiết lập để xác định nồng độ tối ưu.

Đối với sàng lọc nguồn nitơ, 4 nguồn nitơ khác nhau (NaNO₃, NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄ hoặc urê) với nồng độ 1 g/L đã được thêm vào môi trường TSB chứa 10 g/L sucrose và 0,1 g/L tryptophan. Nguồn nitơ tối ưu đã được xác định dựa trên hàm lượng IAA. Sau đó, dựa trên nguồn nitơ tốt nhất, 6 nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 và 10 g/L đã được thiết lập để xác định nồng độ tối ưu.

Tác động của nồng độ tryptophan lên sinh tổng hợp IAA cũng được kiểm tra dựa trên môi trường tối ưu có bổ sung L-tryptophan ở 5 nồng độ khác nhau là 0,01; 0,05; 0,1; 0,3 và 0,5 g/L).

2.2.5. Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp IAA bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM

Để khảo sát sự tác động qua lại giữa các yếu tố trong quá trình sinh tổng hợp IAA, mô hình thiết kế RSM-BBD (Response surface method – Box-Behnken experimental design) được áp dụng. Dựa trên kết quả tối ưu của các thí nghiệm đơn yếu tố, sự tương tác giữa nguồn cacbon, nguồn nitơ và tryptophan được đánh giá. Phần mềm Minitab 16.2.4 đã được sử dụng để thiết kế các thí nghiệm đáp ứng bề mặt và thực hiện phân tích hồi quy và đồ họa.

3. Kết quả

3.1. Phân lập và định danh dòng vi khuẩn tạo bào tử có khả năng sản sinh IAA

Ở nghiên cứu này, 5 dòng vi khuẩn tạo bào tử có khả năng sinh tổng hợp IAA đã được phân lập từ các mẫu đất tại Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh (Bảng 1). Chủng CG2 cho thấy lượng IAA được tổng hợp là cao nhất (37,0 ± 0,5 µg/mL). Kiểm định ANOVA đã chỉ ra sự khác biệt đáng kể trong sản lượng IAA của dòng vi khuẩn CG2 so với 4 dòng còn lại (giá trị p < 0,05). Khuẩn lạc của dòng CG2 trên môi trường thạch TSA có màu trắng đục, răng cưa, bề mặt phẳng và không đều. Hình thái tế bào dưới kính hiển vi cho thấy có dạng hình que, gram dương. Để định danh dòng vi khuẩn CG2, trình tự gen 16S rRNA của chủng CG2 đã được giải mã và phân tích bằng BlastN thông qua NCBI GenBank. Kết quả cho thấy trình tự gen 16S rRNA của chủng CG2 (1366 nucleotide) có họ hàng gần nhất (100%) với trình tự của Bacillus subtilis subsp. stercoris SMPL712 (mã số truy cập CP125578).

Bảng 1. Thông tin các chủng vi khuẩn hình thành nội bào tử có khả năng tổng hợp IAA phân lập từ mẫu đất tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh

3.2. Tối ưu hóa đơn yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp IAA

Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp IAA ở dòng CG2, sáu nguồn cacbon khác nhau được thêm vào môi trường TSB ở nồng độ 1% với sự có mặt 0,1 g/L tryptophan. Lượng IAA được sản sinh cao nhất khi môi trường có bổ sung thêm sucrose. Khi các nồng độ sucrose khác nhau được sử dụng, sản lượng IAA đạt đỉnh ở nồng độ 1% sucrose, trong đó mật độ tế bào và hàm lượng IAA lần lượt là 2,12 ± 0,08 và 47,33 ± 0,72 µg/mL (Hình 1a&b).

Hình 1: Tối ưu hóa nguồn cacbon (a) và nồng độ cacbon (b) bổ sung

Kết quả tối ưu hóa nguồn nitơ cho thấy, trong số 4 nguồn nitơ khác nhau được bổ sung với nồng độ 0,1%, lượng IAA được tổng hợp trong môi trường TSB có sự hiện diện của (NH₄)₂SO₄ là cao nhất. Giá trị cực đại xuất hiện ở nồng độ 0,5 g/L, tại đó mật độ tế bào và sản lượng IAA lần lượt là 2,25 ± 0,12 và 52,17 ± 0,59 µg/mL (Hình 2a&b). Các nồng độ tryptophan khác nhau cũng được sử dụng để phân tích khả năng sinh tổng hợp IAA đối với dòng vi khuẩn CG2. Ở nồng độ 0,1 g/L, mật độ tế bào và hàm lượng IAA là cao nhất, lần lượt là 2,14 ± 0,17 và 46,8 ± 1,25 g/mL (Hình 2c).

3.3. Kết quả tối ưu đa yếu tố quá trình sinh tổng hợp IAA bằng phương pháp RSM

Sucrose, (NH₄)₂SO₄ và tryptophan được nghiên cứu ở 3 mức (−1, 0, +1). Thiết kế thử nghiệm và phản ứng thử nghiệm của quá trình sinh tổng hợp IAA được trình bày tại Bảng 2. Phương trình hồi quy tương quan giữa các yếu tố được xác định và sử dụng để dự đoán kết quả (Bảng 2).

Bảng 2. Ma trận thực nghiệm mô hình RSM-BBD

4. Thảo luận

Indol-3-acetic acid là chất kích thích sinh trưởng thực vật phổ biến nhất của nhóm auxin và nó hỗ trợ nhiều khía cạnh khác nhau của quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật [11, 12]. Nhiều báo cáo chỉ ra rằng vi khuẩn có khả năng sản sinh IAA, điều này đã dẫn đến sự quan tâm ngày càng tăng đối với sự tương tác giữa vi khuẩn và thực vật. Việc phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA cao là điều cần thiết cho các ứng dụng trong nông nghiệp [2, 13, 14]. Trong nghiên cứu này, 5 dòng vi khuẩn hình thành nội bào tử có khả năng tổng hợp IAA đã được phân lập từ các mẫu đất thu thập tại Cần Giờ (Bảng 1). Dòng vi khuẩn CG2 cho thấy khả năng sinh tổng hợp IAA cao nhất so với tất cả các dòng khác (giá trị p < 0,05) và được xác định là Bacillus subtilis dựa trên phân tích trình tự 16S rRNA. B. subtilis thường được công nhận là an toàn, điều này cho phép chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực [15].

Để tăng cường tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, việc tối ưu các yếu tố liên quan đến việc sinh tổng hợp IAA là hết sức quan trọng. Thành phần của môi trường nuôi cấy là yếu tố chính ảnh hưởng đến sản xuất IAA của các loài Bacillus [16]. Để kiểm tra tác động của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp IAA, 6 nguồn cacbon và 4 nguồn nitơ khác nhau đã được thêm vào môi trường TSB. Kết quả cho thấy, nguồn cacbon, nguồn nitơ tốt nhất cho việc sinh tổng hợp IAA ở dòng CG2 là sucrose và (NH₄)₂SO₄ ở nồng độ lần lượt là 1% và 0,05%. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu đã xác nhận tryptophan có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp IAA [2, 13, 14]. Trong nghiên cứu này, việc bổ sung tryptophan ở các nồng độ khác nhau không có tác động đáng kể đến mật độ tế bào. Tuy nhiên, nó dẫn đến sự cải thiện đáng kể trong việc sinh tổng hợp IAA, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây [2, 13, 14].

Khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự tương tác sẵn có của các nguồn cacbon, nitơ và tryptophan cũng được nghiên cứu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng BBD. Kết quả cho thấy, hàm lượng IAA cao nhất là 52,86 µg/mL được dự đoán dựa trên mô hình trong các điều kiện sau: sucrose (X₁) = 1,096%; (NH₄)₂SO₄ (X₂) = 0,0498%; tryptophan (X₃) = 0,0103%. Kết quả thực nghiệm cho thấy lượng IAA đạt được 52,77 ± 0,38 µg/mL ở điều kiện tối ưu, chứng tỏ mô hình dự đoán là phù hợp.

5. Kết luận

Trong nghiên cứu này, 5 dòng vi khẩn tạo bào tử có khả năng sinh tổng hợp IAA đã được phân lập. Trong đó, chủng CG2 cho thấy khả năng sản sinh IAA cao nhất và được định danh là Bacillus subtilis dựa trên trình tự 16S rRNA. Khả năng sinh tổng hợp IAA của B. subtilis CG2 trong điều kiện tối ưu cũng được xác định để tăng cường khả năng ứng dụng trong nông nghiệp.

Lời cảm ơn:

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Trường Đại học Tôn Đức Thắng trong Đề tài mã số FOSTECT.2024.30.

TÀI LIỆU TRÍCH DẪN VÀ THAM KHẢO:

1. Sherpa, M.T., et al., Isolation, Characterization, and Evaluation of Native Rhizobacterial Consortia Developed From the Rhizosphere of Rice Grown in Organic State Sikkim, India, and Their Effect on Plant Growth. Frontiers in microbiology, 2021. 12: p. 713660.

2. Wang, X., et al., Isolation and Characterization of Antagonistic Bacteria Paenibacillus jamilae HS-26 and Their Effects on Plant Growth. BioMed research international, 2019. 2019: p. 3638926.

3. Tuan, N.N., Y.W. Lin, and S.L. Huang, Catabolism of 4-alkylphenols by Acinetobacter sp. OP5: genetic organization of the oph gene cluster and characterization of alkylcatechol 2, 3-dioxygenase. Bioresource technology, 2013. 131: p. 420-8.

4. Kaur, R. and S. Kaur, Plant growth-promoting potential of 'Myroides gitamensis' isolated from virgin soils of Punjab. Archives of microbiology, 2021. 203(5): p. 2551-2561.

5. Li, Y., et al., Colonization and Maize Growth Promotion Induced by Phosphate Solubilizing Bacterial Isolates. International journal of molecular sciences, 2017. 18(7).

6. Muthukumarasamy, R., et al., Isolation of bacterial strains possessing nitrogen-fixation, phosphate and potassium-solubilization and their inoculation effects on sugarcane. Indian journal of experimental biology, 2017. 55(3): p. 161-70.

7. Habibi, S., et al., Isolation and Screening of Indigenous Plant Growth-promoting Rhizobacteria from Different Rice Cultivars in Afghanistan Soils. Microbes and environments, 2019. 34(4): p. 347-355.

8. Nguyen, N.T., et al., Isolation and optimization of a glyphosate-degrading Rhodococcus soli G41 for bioremediation. Archives of microbiology, 2022. 204(5): p. 252.

9. Nguyen, N.T., et al., Identification and Biodegradation Potential of a Novel Strain of Kosakonia oryzae Isolated from a Polyoxyethylene Tallow Amine Paddy Soil. Current microbiology, 2021. 78(8): p. 3173-3180.

10. Nguyen, N.T., Acinetobacter soli SP2 Capable of High-Efficiency Degradation of Food Emulsifier Polysorbate 80. Current microbiology, 2018. 75(7): p. 896-900.

11. Shreshtha, K., et al., Isolation and identification of Rhizospheric and Endophytic Bacteria from Cucumber plants irrigated with wastewater: Exploring their roles in plant growth promotion and disease suppression. Current Research in Microbial Sciences, 2024. 7: p. 100256.

12. Fu, S.F., et al., Indole-3-acetic acid: A widespread physiological code in interactions of fungi with other organisms. Plant Signaling & Behavior, 2015. 10(8): p. e1048052.

13. Khianngam, S., et al., Identification and Optimisation of Indole-3-Acetic Acid Production of Endophytic Bacteria and Their Effects on Plant Growth. Tropical life sciences research, 2023. 34(1): p. 219-239.

14. Lebrazi, S., et al., Screening and optimization of indole-3-acetic acid production and phosphate solubilization by rhizobacterial strains isolated from Acacia cyanophylla root nodules and their effects on its plant growth. Journal, genetic engineering & biotechnology, 2020. 18(1): p. 71.

15. Zhang, X., et al., Applications of Bacillus subtilis Spores in Biotechnology and Advanced Materials. Applied and Environmental Microbiology, 2020. 86(17).

16. Chen, Z.M., et al., Greater enhancement of Bacillus subtilis spore yields in submerged cultures by optimization of medium composition through statistical experimental designs. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010. 85(5): p. 1353-60.

Optimization of indole-3-acetic acid production by Bacillus subtilis CG2

Nguyen Ngoc Tuan¹

Ly Cam Tu¹

¹Faculty of Applied Sciences, Ton Duc Thang University

ABSTRACT:
This study aimed to isolate bacterial strains capable of forming endospores as well as IAA biosynthesis from soil samples collected in Vietnam for application in soil improvement. Five bacterial strains were isolated, of which strain CG2 showed the highest production efficiency. Strain CG2 was identified as Bacillus subtilis based on 16S rRNA sequencing. The main factors affecting IAA biosynthesis were identified and then analyzed for correlation by response surface methodology using Box-Behnken design. The highest IAA production, 52.77 ± 0.38 µg/mL, was obtained under the following conditions: sucrose (X1) = 1.096%; (NH4)2SO4 (X2) = 0.0498%; tryptophan (X3) = 0.0103%. Thus, Bacillus subtilis CG2 has significant potential for agricultural application to enhance crop yield.
Keywords: Indole-3-acetic, bacteria, optimization, Bacillus subtilis, soil improvement, agriculture.